微卫星DNA多态性分析和免疫因子基因克隆在蟹类的应用探索

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种质资源的混杂流失和传染性疾病的流行严重地危害了我国河蟹养殖业的发展。本研究对中华绒螯蟹微卫星DNA进行了遗传多态性研究,探索了微卫星DNA作为分子标记进行分类和鉴定中华绒螯蟹的可能性;克隆和测序了中华绒螯蟹两个重要的体液免疫因子—prophenoloxidase和peroxinectin;初步分析了颤抖病病原体感染与酚氧化酶原系统水平变化之间的关系。 在实验的第一章中,我们对中华绒螯蟹五个地理种群的微卫星DNA多态性进行了分析。首先,我们对报道的微卫星基因座进行了筛选,选取了两个扩增结果较好、电泳条带清晰易读且等位基因数目适中的微卫星基因座——Esin67和Esin87。采用微卫星DNA分型技术,对辽河、固城湖、长江、浙江和莱茵河五个地理种群的中华绒螯蟹共计350个样本,通过DNA提取、PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测的方法,进行了这两个微卫星基因座的遗传多态性分析。结果表明:五个种群中华绒螯蟹的两个微卫星基因座均有较好的遗传多态性,在进行基因型分型时结果清晰易读,可重复性好,且遗传分析结果与其它分类方法的结果相符,准确性较高,是进行中华绒螯蟹分子分类和种质鉴定良好的遗传标记。另外,目前我国长江水系中华绒螯蟹的种质资源与其它水系的河蟹有所混杂,需要加强对其进行种质保护的力度,而欧洲莱茵河流域中华绒螯蟹的遗传距离与长江水系的最近,证实了欧洲地区的中华绒螯蟹是来源于我国长江流域,为中华绒螯蟹的育种工作提供了新的种质资源。 本实验的第二章对中华绒螯蟹两个重要的体液免疫因子prophenoloxidase和peroxinectin进行了部分克隆与测序.这两个分子隶属于甲壳动物体内最主要的体液免疫系统——酚氧化酶原系统,已有部分十足目动物的proPO和peroxinectin分子被克隆和纯化。我们通过在GenBank 比对其它十足目动物这两个分子的基因序列,找出保守区域设计简并引物,并通过RNA抽提、RT—PCR的方法,克隆了部分基因序列。然后,根据测序结果提供的信息,利用3RACE的方法获得peroxinectin分子完整的下游序列。结果显示:中华绒螯蟹proPO和peroxinectin分子的序列片断均与其它十足目动物这两种分子的基因序列有较高的相似性;peroxinectin分子的氨基酸序列片断与十足目动物以及果蝇等昆虫纲动物有较高的同源性,并且中序列有一个与其它物种peroxinectin分子共有的过氧化物酶结构域。 在第三章中,我们进一步研究了中华绒螯蟹酚氧化酶原系统在抵抗外源微生物感染的过程中所发挥的作用。我们使用河蟹病害中危害最为严重的颤抖病作为实验材料来对中华绒螯蟹进行感染,从分子和蛋白水平来研究酚氧化酶原系统在抵抗颤抖病感染的过程中所发挥的作用和机制,在分子水平上,根据前一章分子克隆与测序的结果,我们检测了中华绒螯蟹在患病前后proPO和peroxinectin分子mRNA水平表达的变化;在蛋白水平上,我们检测了酚氧化酶原系统在发挥抗感染作用时酚氧化酶活性的强度。结果发现,与正常对照组相比,感染颤抖病螃蟹的酚氧化酶原系统在分子和蛋白水平上都有明显的变化。分子水平上,两种体液免疫分子mRNA的表达均明显升高;蛋白水平上,患病螃蟹的酚氧化酶活性也有所升高。这些结果表明酚氧化酶原系统在抗感染过程中发挥重要作用,为进一步了解蟹类的免疫防御系统和研究如何检测、预防和治疗颤抖病提供了理论基础。
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