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许多具有特异疗效的生物大分子药物采用口服给药难以通过肠道吸收进入血液循环,极大地限制了其应用。壳聚糖(Chitosan, CS)作为口服药物载体具有打开上皮细胞紧密连接(TJ)增强药物细胞旁路运输的能力,壳聚糖／羧甲基壳聚糖(CS/CMC S)纳米载体能够更有效地促进口服药物透肠吸收,提高口服生物利用度,但CMCS结构与肠道细胞作用的分子机制尚不明确。本文通过制备具有不同取代度的CMCS材料体系,以Caco-2细胞构建肠道吸收模型,研究了CMCS不同分子结构与其作为载体材料促进口服药物透肠吸收之间的关系。利用壳聚糖(CS)与氯乙酸反应技术,通过控制反应时间,成功合成了三种羧甲基壳聚糖(CMCS)样品,分别命名为CMCS1、CMCS2和CMCS3。在中性条件下,CMCS2和CMCS3比CMCS1表现出更好的水溶性；三种CMCS样品红外光谱图证实羧甲基基团(-CH2COOH)成功地连接到了CS的分子骨架上,羧基特征峰面积的差异反映出羧基含量的不同：CS原料的分子量为397.5kDa, CMCS1、CMCS2、CMCS3的分子量分别为449.1kDa、540.7kDa和605.1kDa,羧甲基取代度分别为36%、100%、145%,产物的分子量和取代度随反应时间的延长而增大。CMCS1和CMCS2的羧甲基取代主要发生在C6位的-OH上,产物以O-CMCS为主。CMCS3的羧甲基取代在C6位的-OH达到饱和后继续发生在C2位的-NH2上,生成产物主要为N,O-CMCS;三种CMCS样品中由于引入了羧基基团(-COO-),其Ca2+螯合能力均显著高于CS原材料,且随着羧甲基基团取代度的增加,Ca2+螯合能力逐渐增强。通过MTT法评价了CS原料和三种取代度CMCS样品的细胞毒性,72h实验结果表明,浸提液浓度在0.0625mg/mL-1mg/mL范围内,各实验组的细胞相对增殖率均超过1 00%,四种材料对HUVEC、MEF和Caco-2细胞均表现出良好的细胞相容性。并且,CS、CMCS1、CMCS2和CMC3对HUVEC和MEF的生长都有明显的促进作用,在实验浓度范围内,促生长作用随着材料浸提液浓度的提高而增强。TEER分析结果表明,0.25mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/ml浓度的CS和三种CMCS样品浸提液处理Caco-2细胞致密单层后,细胞单层TEER值在1h内表现为先迅速下降后逐渐上升。TEER值降低速度随材料浓度的增加而增大,TEER值最大降幅随CMCS羧甲基取代度的增大而增大。全部实验组对Caco-2细胞致密单层作用过程均表现出可逆性。其中,05 mg/ml和1mg/ml CMCS3具有明显较强的打开细胞TJ的能力。紧密连接蛋白Claudin-4免疫荧光研究发现,0.5 mg/ml的CS和CMCS3作用前,细胞膜上存在大量Claudin-4蛋白,细胞间的TJ处于完整状态；作用15min后,荧光信号明显减弱,Claudin-4蛋白急剧减少,细胞间TJ被打开；作用30min和60min后,荧光信号明显增强,Claudin-4蛋白量持续增加,细胞间TJ逐渐恢复。免疫荧光实验结果与TEER分析结果一致,均证实CMCS3能够有效打开Caco-2细胞之间的TJ结构,从而增加细胞旁通路的渗透性。研究发现,高取代度的CMCS表现出更强的打开细胞TJ的能力。一方面依赖于其介导的跨膜蛋白Claudin-4在细胞膜上的转移和重新分布,另一方面通过其更强的Ca2+螯合能力使钙粘素因Ca2+流失而失活,破坏细胞粘附连接(AJ)结构进而打开细胞TJ。该研究结果为对羧甲基壳聚糖载体材料进行精确的分子设计,研究与开发高效、安全的口服药物载体奠定了基础。