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蛋白质酪氨酸硝化是一种重要的蛋白质翻译后选择性修饰,其产物3-硝基酪氨酸(3-NT)可以作为检测细胞和组织损伤的一个生物标志。目前已有证据表明3-NT与多种疾病,如帕金森、阿尔茨海默病、孤独症相关。本课题利用表面等离激元共振(SPR)生物传感技术来实现对尿样中3-NT浓度的实时监测。SPR生物传感器具有灵敏度高、检测速度快、样品消耗量少、无需标记等优点,已经广泛应用于生物化学、食品安全、环境监测等领域。
本课题中,构建了以小型化SPR传感模块Spreeta为核心部件,结合了匹配工作支架、微流样品池、精密恒流进样系统等外围设备的小型化SPR仪,将其用于3-NT检测。通过层层自组装技术,在SPR传感器的金膜表面建立了3-NT分子敏感膜,并对制备分子敏感膜的工艺进行了优化,提高了敏感膜的均一性,稳定性,降低检测时的背景噪声.
针对3-NT为性质稳定的小分子这一情况,我们采用免疫抑制原理对其进行检测。将3-NT-BSA通过氨基偶联法固定到传感器金膜表面,待检测溶液与结合缓冲液(一定浓度的抗体溶液)混合孵育至反应平衡,将混合溶液进样到传感器表面,固定在传感器表面的3-NT与待检测溶液中的3-NT竞争结合抗体,传感器输出响应值与待测3-NT浓度负相关。测定系列浓度3-NT标准溶液的响应值,拟合出工作曲线。将尿样与结合缓冲液混合孵育,上样到传感器表面,获取其响应值,比对工作曲线,即可知尿样中3-NT浓度。建立的检测方法的检测限为4.7ng/mL,定量检测限为20ng/mL,线性工作范围为20ng/mL～4.8μg/mL,工作曲线的相关系数为R2=0.997。连续测定同一浓度样品3次,日内变异系数为4.4％(n=3),连续测定同一浓度样品15天,日间变异系数为12.25%(n=15),说明本方法有良好的重复性。本方法能够很好区分3-NT和3种结构类似物,有良好的特异性。在实际尿样检测中,我们对尿样进行高低浓度加标回收,回收率为95%～115.8%,检测方法的准确性能够满足实际检测要求。