植物多酚(Plantpolyphenol)又名植物单宁(Vegetabletannin),为植物体内的具有多种药物活性复杂酚类次生代谢物,天然存在的植物多酚大部分都是以生理活性低的结合型糖苷形式存在,酶法去掉糖基则是最经济环保的修饰方法,而目前广泛使用的是β-葡萄糖苷酶,但由于其对底物的苷元作用的具有选择性,因此如何提高其对植物多酚化合物的去糖基作用是现在研究的重点。嗜热菌海栖热袍菌Thermotoga maritimaMSB8所产的β-葡萄糖苷酶(Tm-BglA)属于水解酶家族1,具有良好的热稳定性,并可以将黄酮化合物中的结合类糖苷转化为游离类的苷元。本课题通过Tm-BglA与纤维四糖的分子对接结果,预测Tm-BglA的苷元结合位点,并与九种来源于不同植物、微生物的同属水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列进行多序列比对,将位于Tm-BglA蛋白结构中β-4折叠股上靠近苷元结合位点的W168、β-5折叠股上靠近苷元结合位点的N223、G224以及α-5螺旋股上靠近苷元结合位点的N246等四个氨基酸分别进行定点突变,对Tm-BglA进行定向改造。主要通过反向PCR的方法,构建突变酶W168Y、W168S、N223T、N223S、G224F、N246S 以及双突变 N223S/G224T。为了研究并提高Tm-BglA对植物多酚糖苷类底物底物特异性,以质粒pHsh作为载体,共构建了七个重组质粒。将成功构建突变重组质粒转入到大肠杆菌宿主中,借助于His-tag标签,使用镍离子亲和柱进行表达纯化,借助于聚丙烯酰胺凝胶电泳,验证发现纯化效果纯度较高。以对硝基苯酚β-D-葡萄糖苷为底物,从酶的最适温度、最适pH、温度耐受性、pH耐受性,以及动力学参数方面研究七个突变酶的酶学性质,与突变前的Tm-BglA进行比较,结果表明168位、223位、224位和246位这四个位置上的点突变不影响Tm-BglA的正常表达,对Tm-BglA 的整体结构也未造成影响,没有引起 Tm-BglA 的最适条件、稳定性上的显著变化,但对于人工底物pNPG的动力学参数产生了一定影响。通过各个突变酶对植物多酚的水解效率进行测定,发现通过点突变构建的突变酶,各酶对大豆异黄酮的水解活性与野生型酶相比均有不同程度的降低,对槲皮素糖苷、虎杖昔、牛蒡子苷水解活性也有不同的影响,其中含N223、G224点突变的突变酶与Tm-BglA相比较,对槲皮素-3,4’-O-葡萄糖、槲皮素-4。-O-葡萄糖、槲皮素-3-O-葡萄糖、虎杖苷、牛蒡子苷的转化率都有了一定提高。通过高效液相色谱对结果进行分析,其中双突变N223S/G224T对槲皮素各糖苷的水解效率在l0rmin时均超过90%,较Tm-BglA均50%以上的提高;突变酶N223T、G224F对对虎杖苷、牛蒡子苷的水解效率较野生酶Tm-BglA均有不同程度的提高,;而G224F在反应达到l0min时,其对对牛蒡子苷的转化率为50.7%,较Tm-BglA 提高 16.9%。结合分子对接对实验的结果进行分析讨论,分析槲皮素-4’-O-葡萄糖与Tm-BglA之间相互作用,计算得出两者的结合自由能为-10.87kcal/mol,223位氨基酸由天冬酰胺突变为丝氨酸,及224位突变为苏氨酸后,酶与底物的空间距离更加贴近;将Tm-BglA与虎杖营进行对接结果,计算得出两者的结合自由能为-8.11kcal/mol,将223位氨基酸由天冬氨酸突变为苏氨酸,224位氨基酸突变为苯丙氨酸之后,空间距离明显缩短;而通过Tm-BglA与牛蒡子苷的对接结果发现,Tm-BglA与牛蒡子苷的结合自由能为-5.49kcal/mol,将223位氨基酸由天冬氨酸突变为苏氨酸,224位氨基酸突变为苯丙氨酸之后,空间距离明显缩短。