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研究目的柯萨奇病毒为小RNA科肠道病毒属的成员,1948年Dolldorf等在纽约市柯萨奇镇脊髓灰质炎病毒流行期间,通过接种乳鼠首次分离出柯萨奇病毒。柯萨奇病毒多感染5岁以下儿童,主要表现为手足口多部位的疱疹,少数可引起心肌炎和神经系统的损伤。据报道,引起手足口病的主要病原体为EV71型和CVA16型,但近几年来引起手足口病的血清型不断变化。本研究通过原核表达系统成功表达出CVA6、CVB4型柯萨奇病毒的VP1蛋白,并建立针对该蛋白的ELISA检测方法,进一步选取本实验室分离到的CVA6和CVB4毒株,制备针对VP1蛋白的单克隆抗体,为手足口疫情监测及快速诊断方法的建立提供技术支持。1.柯萨奇病毒CVA6和CVB4VP1蛋白的原核表达及ELISA方法的建立本研究将柯萨奇病毒CVA6和B4的VP1基因连接到原核表达载体pET-32a上,转化到大肠杆菌DH5α中,测序鉴定阳性质粒,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,VP1蛋白可大量表达。SDS-PAGE分析显示,表达的重组蛋白分子量约为50k Da。纯化的CVA6和CVB4 VP1蛋白经质谱鉴定结果均正确。以纯化的重组蛋白为包被抗原,分别进行间接ELISA方法反应体系的建立和条件优化,确定CVA6 VP1抗原最佳包被浓度分别为8 ug/孔;血清最佳稀释倍数为200倍,最佳孵育时间为60 min;酶标二抗最佳工作浓度为1:1600。应用上述方法对15份CVA6阴性血清、CVA6阳性血清、EV71及其他型别柯萨奇病毒阳性血清分别进行检测,结果显示本研究纯化的CVA6衣壳蛋白VP1具有良好的抗原性,建立的间接ELISA方法具有很高的特异性、敏感性和可重复性。用同样的方法建立针对CVB4的间接ELISA方法,确定CVB4 VP1抗原最佳包被浓度分别为7.5 ug/孔;血清最佳稀释倍数为100倍,最佳孵育时间为60min;酶标二抗最佳工作浓度为1:1600。应用上述方法对18份CVB4阴性血清、CVB4阳性血清、EV71、CVB3及其他型别柯萨奇病毒阳性血清分别进行检测,结果显示与CVB3有一定交叉反应,与其他病毒感染血清未发生交叉反应。本研究纯化的CVB4衣壳蛋白VP1具有良好的抗原性,建立的间接ELISA方法具有较高的特异性、敏感性和可重复性。本方法可应用于CVA6和CVB4感染后的血清抗体检测,为诊断试剂的研发及鼠源性单克隆抗体的研制奠定了基础。2.CVA6和CVB4单克隆抗体的制备和鉴定将纯化好的CVA6和CVB4病毒与弗式佐剂混合均匀后对6周龄BALB/c小鼠进行免疫,免疫三次测定小鼠血清效价达1:5000后取小鼠的脾细胞与处于指数增长期的SP20骨髓瘤细胞在细胞融合剂PEG作用下融合,利用间接ELISA检测方法筛选杂交瘤细胞,共获得2株CVA6和4株CVB4的杂交瘤细胞株。把杂交瘤细胞注入小鼠腹腔生产腹水,并利用间接ELISA方法测定腹水单抗效价分别为10~4、10~5、10~5、10~4、10~4和10~6。对6株单抗进行了初步的鉴定,CVA6-1、CVA6-2亚型均为IgM,CVB4-1、CVB4-2、CVB4-3、CVB4-4亚型分别为IgM、IgA、IgM、IgA。间接免疫荧光观察到CVA6病毒感染的细胞与2株针对CVA6的单抗有特异性亮绿色荧光,CVB4病毒感染的细胞与4株针对CVB4的单抗有特异性亮绿色荧光,制备的CVA6和CVB4单抗特异性较好。