论文部分内容阅读
禽多瘤病毒感染症(Avian Polyomavirus infection，APV感染症)和鹦鹉喙羽病(Psittacine Beak and Feather Disease，PBFD)被认为是影响禽类羽毛和外观的两大代表性疾病。鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)，属于圆环状病毒科(Circoviridae)环状病毒(Circovirus)，可感染约60种的野生及宠物鹦鹉，能引起患乌免疫抑制，危害严重。此病在我国台湾有过报道，在大陆还未曾见过报道。APV感染症，又称鹦鹉幼雏病，主要引起鹦鹉幼雏的急性致死性疾病，其死亡率可高达100％。本文主要完成了以下工作:
(1)利用PCR方法对来自山东的9份濒死虎皮鹦鹉病料进行APV和PBFDV的检测，9份病料中有6份PCR检测为APV阳性，1份检测为PBFDV阳性，2份为APV和PBFDV混合感染，PCR产物序列分析的结果可以确认本病例鹦鹉有PBFDV和APV的感染，这是我国大陆首次报道鹦鹉喙羽病，也是我国大陆首次报道虎皮鹦鹉APV和PBFDV的混合感染。
(2)利用分段PCR扩增的方法对APV和PBFDV的全基因组进行了扩增，测序结果分析可知，本文分离到了2株APV分离株，一株为青岛株QD-JM01，一株为潍坊株WF-GM01;此外，在青岛养殖场还分离到一株PBFDV分离株QD-CN01，为我国大陆分离到的第一株PBFDV。
Blast分析，综合DNAstar软件分析可知，APV分离株QD-JM01株和WF-GM01与GenBank中全部的APV毒株同源性极高，为99.3％～99.9％。全基因组序列多重比对分析表明，QD-JM01株共有11处发生了核苷酸变异，最显著的是在第246位(非编码区)插入了14个碱基，有3处能引起氨基酸的变异。WF-GM01株有14个位点发生碱基改变，其中VP1变异率最高，有5个碱基位点发生改变。其次T抗原变异率较高，有4处碱基发生改变，其中，VP1区域及T抗原分别有4个位点引起氨基酸变异。PBFDV青岛分离株QD-CN01，全长2003bp，与GenBank中已发表PBFDV分离株全序列同源性为83.0％～95.0％。与之前报道的PBFDV呈现相似的基因组结构，包括主要ORF的大小以及位置，位于Cap和Rep之间的茎环结构的序列及位置等。利用Mega4.0软件构建系统进化树，分析表明这些同源性极高的APV分离株，与地理分布没有明显关联，并不形成地理隔离，与宿主也不呈明显关联;来源于不同宿主的PBFDV分离株与宿主关系紧密，与地理来源也呈一定相关，我国的QD-CN01分离株位于由6株分离自日本的分离株构成的虎皮鹦鹉特异基因型分支上。
(3)根据已测鹦鹉喙羽病病毒青岛分离株(QD-CN01)全基因序列，设计一对表达QD-CN01株ORFC1基因(750bp)的引物，将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组pET-ORFC1质粒。通过对诱导时间，IPTG终浓度，以及菌体OD值进行筛选优化，经IPTG诱导后成功地在BL21宿主菌中表达分子量约为28.9kDa的融合蛋白。蛋白表达的PBFDV重组衣壳蛋白可以作为免疫原制备抗血清及单克隆抗体，也为研制基因工程疫苗和诊断试剂盒提供必备的筛选用试剂。