背景和目的LKB1基因作为抑癌基因,不仅在家族遗传性疾病中有较高的突变率[1],在非小细胞性肺癌、乳腺癌、宫颈癌、鳞状细胞癌、胰腺癌及结直肠癌等散发性肿瘤中也存在LKB1基因的体细胞突变[2-5]。LKB1在细胞周期阻滞、信号转导通路、细胞极性排列、能量代谢等方面起着重要作用。研究证实,LKB1基因突变或者失活导致的功能缺失可以协助一些癌基因的异常表达,不仅可以促进细胞的恶性增殖,还与细胞的迁移侵袭等有关。然而,目前对于LKB1调节细胞增殖和迁移的作用机制还不明确。本课题旨在通过合成LKB1重组质粒和LKB1小RNA干扰片段,将重组质粒和小RNA干扰片段分别转染不同的大肠癌细胞株,研究LKB1表达上调和下调后对大肠癌细胞增殖和迁移能力的影响,同时检测参与LKB1调节机制的相关信号通路蛋白,以进一步了解LKB1参与大肠癌发生发展的分子机制,同时也为大肠癌的基因治疗探讨新思路。材料与方法1、主要材料SW1116, SW480, SW620, Colo205及HCT116细胞株由南方医院消化病研究所细胞培养室保存。LKB1表达载体购自Genecopoeia、LKB1小RNA干扰片段由上海吉玛制药有限公司合成；无内毒素质粒大量提取试剂盒(Omega)、 RPMI-1640(GIBCO)、LipofectamineTM2000(Invitrogen)、Opti-MEN(Invitrogen)、 Trizol(TAKARA)、逆转录试剂盒(Invitrogen)、聚合酶链反应试剂盒(TAKARA)、CCK-8试剂盒和细胞核浆蛋白提取试剂盒(碧云天生物技术公司)、Transwell小室(Bio-rad)、LKB1(Santa Cruz)、β-catenin (Cell Signaling)、cyclinD1(中杉金桥)、Claudin-1(Cell Signaling)、MMP-7(Bio-world)、β-actin(中杉金桥)。2、主要方法2.1LKB1真核表达载体的鉴定以LKB1重组质粒及空质粒为模板,PCR扩增目的片段,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物以及测序鉴定。按TAKARA说明书的PCR体系进行加样,PCR反应参数设置：95℃预变性5min,然后95℃变性30sec,60℃退火45sec,72℃延伸50sec,31个循环,72℃延伸7min,1%琼脂糖凝胶电泳检测。2.2LKB1在消化道肿瘤细胞中的基因表达检测利用RT-PCR鉴定LKB1在各细胞株中的基因表达。按TAKARA的Trizol说明书提取细胞总mRNA,使用I=nvitrogen的cDNA逆转录合成试剂盒,按说明书将mRNA逆转录为cDNA, PCR扩增LKB1目的片段与内参GAPDH片段,PCR体系及反应条件同上,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。2.3LKB1在消化道肿瘤细胞中的蛋白表达检测利用Western blotting鉴定LKB1在各细胞株中的蛋白表达水平。预冷的RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,加入SDS上样缓冲液煮沸变性,一20℃保存。配制10%蛋白电泳分离胶和5%积层胶,蛋白上样后(上样量40gg)进行电泳,湿转法将蛋白转移至PVDF膜,应用TBST(含0.1%Tween20)配制的5%的脱脂奶粉封闭1.5h,按抗体说明书的要求加入相应浓度的一抗,4℃,摇床振荡过夜；去除一抗后,相应HRP结合的二抗(1：3000)室温下孵育1小时。TBST洗膜去除二抗后,应用ECL化学发光液发光。2.4细胞培养和瞬时转染各细胞应用含10%FBS的RPMI-1640完全培养液培养,均置于37℃、5%CO2、湿度充分的培养箱中常规培养。六孔板中细胞生长至约80%-90%融合度时,按Invitrogen公司Lipofectamine2000TM试剂说明书进行转染,转染6h后改用10%FBS的1640完全培养基,48h后提取总RNA和蛋白,采用RT-PCR和Western blotting检测目的基因(LKB1)的表达。2.5LKB1siRNA转染并筛选出最有效干扰片段六孔板细胞生长至40-50%时融合度时转染,按Invitrogen公司Lipofectamine2000TM说明书进行操作,48h后提取总RNA和蛋白,利用RT-PCR和Western blotting检测siRNA干扰效果并筛选最有效干扰片段。2.6CCK-8实验检测细胞增殖0.25%胰酶消化处于对数生长期的大肠癌细胞,按每孔3000个细胞(增殖实验)或5000个细胞(增殖抑制实验)的细胞密度接种于96孔板(100ul/孔),常规培养24h,然后按Invitrogen公司Lipofectamine2000TM说明书转染各组细胞,每组设3个复孔,不同处理时间后,加入CCK-8溶液(10μl/孔),培养箱内反应2h,应用酶联免疫标记分析仪测定,记录各孔450nm波长处的吸光度OD值。2.7Transwell小室迁移实验Transwell、室评估细胞的迁移能力。按实验目的处理各组细胞后,用含1%FBS的1640完全培养基制备成细胞悬液,密度为2×107/ml。在Transwell小室的下室中预先加入600μl含20%FBS的1640培养基,37℃平衡1h,然后上室加入100μl细胞悬液,培养48h后,取出小室,棉签擦去上室残留细胞,4%多聚甲醛固定30min,0.1%结晶紫染色,PBS充分洗涤。显微镜(200×)随机选择5个视野进行细胞计数。2.8检测Wnt通路关键基因P-catenin及下游靶基因的表达上调或者下调LKB1表达后用半定量RT-PCR方法检测Wht/β-catenin信号通路的关键基因β-catenin的基因表达情况,其蛋白表达以及下游靶基因cyclinD1、Claudin-1、MMP-7蛋白表达采用Western blotting检测。2.9统计学处理实验结果应用SPSS13.0软件统计分析,计量数据以均数±标准差表示。CCK-8实验中,各组数据比较采用析因分析的方差分析；细胞迁移实验中,两组穿透聚碳酸酯膜的细胞数比较采用两独立样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1LKB1在不同的大肠癌细胞株中存在差异表达RT-PCR检测发现LKB1mRNA在W1116细胞中表达较低,而在SW480、SW620、Colo205和HCT116细胞中均高表达。Western blotting从蛋白质水平检测LKB1的表达,其结果和RT-PCR的结果一致。提示LKB1在不同大肠癌细胞株中存在差异表达。2LKB1重组质粒的鉴定结果质粒测序证实重组质粒插入片段与Genebank上的序列完全一致；以LKB1重组质粒和空质粒为模板进行PCR聚合酶链反应,获得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,重组质粒组获得目的片段条带,而空质粒组则没有相应条带。3LKB1过表达可抑制SW1116细胞的增殖及迁移将LKB1表达质粒和空质粒转染SW1116细胞,分别命名为SW1116-LKB1细胞和SW1116-Vector细胞,于转染后24h、48h、72h、96h应用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况。与SW1116-Vector细胞和空白组SW1116细胞比较,SW1116-LKB1细胞的增殖速度明显减慢(F=89.396, P=0.000),提示LKB1过表达可以抑制SW1116细胞的恶性增殖。Transwell小室迁移实验显示,SW1116-LKB1细胞穿过小室聚碳酸酯膜的细胞数较SW1116-Vector细胞减少(t=43.819,P=0.000)。4LKBl的小RNA干扰片段筛选结果选用SW480细胞,分别转入3条LKB1小RNA干扰片段(siRNA1455、siRNA1391、siRNA927),经RT-PCR及Western blotting鉴定发现,siRNA1455片段干扰效果最佳。5.LKB1低表达可促进SW480细胞的增殖及迁移将LKB1siRNA1455片段和无意义干扰片段转染SW480细胞,分别命名为LKB1-siRNA和NC-SW480,于转染24h、48h、72h、96h应用CCK-8法检测细胞增殖情况。与NC-SW480细胞和空白组SW480细胞比较,LKB1-siRNA细胞增殖速度明显增快(F=711.856,P=0.000),提示LKB1低表达促进了SW1116细胞的增殖。Transwell小室迁移实验显示,LKB1-siRNA组细胞穿过小室聚碳酸酯膜的细胞数较NC-SW480组增加(t=35.034,P=0.000)。6LKBl的表达对Wnt/p-catenin通路分子的影响为了阐明LKB1调节细胞增殖和迁移的机制,我们采用RT-PCR和Western blotting检测了Wnt通路上的关键因子P-catenin的基因表达和蛋白表达变化。与SW1116-Vector和SW1116细胞相比,转染LKB1表达质粒后可降低细胞内β-catenin的转录翻译活性,同时,Western bloting结果提示LKB1过表达可以抑制β-catenin的胞浆胞核移位。cyclinD1、Claudin-1、MMP-7是Wnt/β-catenin通路下游重要的代表因子,参与细胞的增殖和迁移侵袭。结果显示,SW1116-LKB1细胞中上述靶基因的mRNA和蛋白表达水平均较SW1116-Vector和SW1116细胞低。为了进一步明确LKB1对Wnt通路的调节作用,我们采用siRNA干扰技术敲低SW480细胞内LKB1的表达,与NC-SW480和SW480细胞相比较,LKB1-siRNA细胞中β-catenin及其靶基因的蛋白表达水平均增高,提示LKB1低表达可促进Wnt/β-catenin通路的转录活性。结论本研究通过体外实验发现,LKB1在结直肠肿瘤细胞中存在差异表达；高表达LKB1可以抑制SW1116细胞的增殖和迁移,而且降低Wnt/β-catenin通路分子开关P-catenin的mRNA及蛋白表达水平,并促使P-catenin发生胞浆胞核移位。而干扰LKB1基因表达可以促进SW480细胞的增殖和迁移,并且诱导P-catenin在细胞内的表达增加。同时,LKB1参与Wnt/β-catenin通路下游靶蛋白的活性调节。这些结果提示,LKB1在大肠癌的发生发展中起重要作用,其与Wnt/β-catenin通路的相互作用可能是大肠癌细胞生长增殖的重要分子机制,对其相互关系的探讨可以完善LKB1参与调节大肠癌发病机制的研究,同时为大肠癌的临床个体化治疗提供新的理论依据。