背景和目的:日常生活中由于交通事故、生产事故、自然灾害等常见原因,创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)的发病率一直居高不下,部分患者残留肢体残疾、严重者甚至发生死亡,严重影响着人类的生命健康、生活质量和财产安全。由于神经细胞毁损后自身欠缺再生能力,创伤性脑损伤后的多数幸存者中会出现神经功能的不全或缺失,从而丧失部分或全部的劳动生产能力和生活自理能力,给社会和家庭带来了庞大的负担。神经功能的保护和修复作为创伤性脑损伤后临床治疗中的关键所在,一直以来面临着严峻的挑战,对于伤后出现的神经功能障碍尚无特异性明确有效的治疗方法。因此需要我们探索新的行之有效的治疗方法来改善目前困窘的局面。由于中枢神经系统损伤后自身修复的局限性,人们发现神经干细胞(neural stem cells,NSCs)后所进行的治疗作用的研究,让我们看到了胜利的曙光。目前神经干细胞的体外研究已日趋成熟,尝试神经干细胞移植治疗创伤性脑损伤也得到了越来越多的重视。本研究中从神经干细胞的分离培养入手,在体外对神经干细胞进行标记、鉴定,研究其增殖能力及诱导分化后的表型特点。在此基础上将体外标记好的神经干细胞移植到模型鼠脑内,观察神经干细胞在宿主脑内的分布、迁移和分化,从形态结构和神经功能恢复等方面来评估细胞移植治疗的修复作用,为脑外伤的治疗探索新途径并提供理论佐证。研究内容:1.体外培养神经干细胞的鉴定及诱导分化后的表型特征方法:取1-2d新生昆明小鼠,机械分离海马、嗅球组织,并提取其中的细胞。体外筛选培养3周后,选取稳定悬浮的细胞进行BrdU标记,进行抗BrdU+Nestin+Hochest33258免疫荧光复合染色鉴定所培养细胞的类型。体外诱导促使神经干细胞发生贴壁、分化,对分化产生的子代细胞进行抗BrdU、β-TubulinⅢ、GFAP、Hochest33258免疫荧光复合染色确定分化表型。2.创伤性脑损伤后移植神经干细胞的研究方法:采取改良的Feeney氏自由落体法撞击构建所需的实验动物模型,建模后1d进行神经干细胞移植,分别在移植当天(移植后0d)、移植后3d、移植后7d、移植后14d、移植后21d进行神经功能损伤程度(NSS)评分及疲劳转棒测试,移植后7d、21d进行抗Brdu、Nestin、GFAP、β-TubulinⅢ免疫荧光染色。结果:1.从新生鼠海马及嗅球组织提取得到的细胞经连续传代培养后可形成稳定悬浮的类球形桑葚状细胞团,且抗BrdU+Nestin+Hochest33258免疫荧光复合染色均呈阳性。所提取的细胞体外诱导分化后可产生(抗BrdU+β-TubulinⅢ+Hochest33258)阳性、(抗BrdU+GFAP)阳性的子代细胞。2.移植后7d、14d、21d神经干细胞移植组的NSS评分分别为(10.22±1.42、7.44±1.17、6.22±1.06),对照组的NSS评分分别为(12.44±2.01、9.44±1.91、7.33±1.63),神经干细胞移植组的NSS评分低于对照组,有统计学差异(P<0.05);移植后14d、21d神经干细胞移植组的疲劳转棒时间分别为(274.21±4.34s、292.88±4.53s),对照组的疲劳转棒时间分别为(244.32±9.55s、250.48±10.87s),神经干细胞移植组的疲劳转棒时间长于对照组,有统计学差异(P<0.05);移植后7d脑组织切片行免疫荧光染色发现BrdU/Nestin双阳性细胞局限于移植进针的“隧道”,移植后21d脑组织切片行免疫荧光染色在脑损伤区域及周围发现BrdU/GFAP双阳性细胞及BrdU/β-TubulinⅢ双阳性细胞。结论:1.新生鼠海马、嗅球的组织中含有丰富的神经干细胞来源,体外培养的神经干细胞能够进行自我更新、增殖,在传代培养的过程中多个单细胞聚拢抱团趋向于形成稳定悬浮的神经球,经体外诱导分化后可见神经元和星形胶质细胞等细胞表型。2.部分神经干细胞移植入宿主脑内后能够存活、迁移并在受损区域发生分化形成星形胶质细胞和神经元,在创伤性脑损伤后一定的时间窗内能够促进受损神经功能的改善。总之,移植的外源性神经干细胞对创伤性脑损伤有一定的修复作用,但其长远的疗效及具体的治疗机制仍有待进一步的深入研究。