新城疫（Newcastle disease, ND）是一种由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）感染导致的高度接触性传染病。NDV能够感染多达240多种禽类，强毒NDV能够引起呼吸道、神经系统以及消化道的严重病变。NDV是单股不分节段的负股RNA病毒，隶属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）禽腮腺炎病毒属（Avulavirus）。副粘病毒科其他成员例如麻疹病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒和腮腺炎病毒能够感染多数哺乳动物甚至人并引起严重的疾病。尽管近年来反向遗传学技术的发展给我们对NDV的致病机理研究带来了很大便利，但病毒作为一种专性寄生性生物，在宿主体内的复制很大程度上决定于宿主生物对其的抵抗性以及病毒的逃逸机制，这就促使我们更多的从宿主角度来重新看待病毒的致病过程。自噬（Autophagy）是进化学上保守的一种细胞内膜运输的过程，是细胞内物质成分转运至溶酶体被降解过程的统称，主要通过降解细胞中损坏的或不需要的成分来负责压力条件下细胞内环境的稳态。正常情况下，细胞自噬的基础水平维持在较低的水平以维持细胞内稳态，当细胞处于某些应激状态下，例如心脏病、肿瘤和传染病发生过程中，自噬水平迅速升高，通过细胞内组分的代谢提供能量和大分子物质来度过“危机”。由于进化中的保守型，自噬能够作为机体的固有防御机制发挥对病毒的抵抗性。另一方面，病毒作为专性细胞内寄生物，在长期与细胞自噬这种保守的细胞内膜运输过程互相影响的进化过程中，不但具备了逃逸宿主细胞自噬的功能，甚至能够利用自噬来促进自身复制。目前已有很多关于病毒和自噬相互作用的报道，为了探究NDV在禽源细胞中如何诱导自噬以及自噬对NDV的复制起如何作用，我们开展了如下研究：1）NDV能够在禽源细胞中诱导自噬稳态的产生。为了观察NDV感染禽源细胞后能否诱导细胞自噬，我们用NDV感染禽源成纤维细胞系DF-1后，以透射电镜，激光共聚焦和Western-blot方法鉴定自噬稳态的产生，结果表明：NDV Herts/33株感染DF-1细胞后12-24h能在细胞中发现大量双层或单层膜结构；转染的GFP-LC3质粒在病毒感染后呈现显著的点状分布，尤其在NDV感染形成的合胞体中明显；LC3B的Western-blot结果显示病毒感染后期LC3-I向LC3-II的转化，但以紫外灭活病毒则不能诱导LC3的转化。同时我们还以另一种NDV毒株F48E8和原代成纤维细胞CEF进行验证，以上结果均显示NDV感染能够诱导自噬稳态的产生。2）NDV能够在禽源细胞中诱导自噬流的产生。评价自噬水平的高低不仅仅指自噬体的形成，更重要的是整个自噬系统的流动水平的高低，即稳态自噬水平的增高有可能是自噬起始的增加亦或是自噬降解的减少两方面结果。为了验证NDV感染能否诱导完整自噬的产生，我们在NDV感染之后检测了自噬流标志蛋白p62的降解，溶酶体抑制剂E64d和pepstatinA处理之后LC3-II的变化以及GFP-LC3荧光的转移。结果表明NDV感染能够诱导p62蛋白的降解，同时以溶酶体抑制剂处理之后观察到LC3-II的显著增加，共聚焦结果显示GFP-LC3在病毒感染中后期发生向溶酶体的转移。以上结果均显示NDV感染能够诱导完整自噬流的产生。3）通过药物或自噬相关基因的干扰将自噬阻断能够影响NDV的复制。为了进一步探究自噬对NDV复制的影响，我们首先利用自噬抑制药物渥曼青霉素和氯喹处理DF-1细胞，发现药物阻断自噬之后细胞中的病毒蛋白和细胞上清中的病毒滴度都有所降低，并且这种降低呈现药物依赖性。为了排除药物的非特异性，我们将自噬关键基因Beclin1进行干扰，发现Beclin1的干扰降低病毒的复制。同时我们以NDV感染自噬关键基因Atg5knockout鼠成纤维细胞系（MEFs）和野生型MEFs，发现Atg5的敲除显著降低了NDV的复制。以上结果显示自噬在NDV复制过程中起到了有利的作用。4）NDV的结构蛋白与自噬相关蛋白互作。为了进一步从机理上解释NDV与自噬的直接关系，我们利用激光共聚焦和免疫共沉淀（Co-IP）的方法对NDV结构蛋白NP, P, M和自噬相关蛋白Beclin1和LC3B进行互作研究，结果显示NDV结构蛋白NP, M能够与Beclin1互作，而M还能与LC3B互作，这些结果显示自噬与NDV的复制直接相关。5）体外实验结果证明NDV能够在DF-1细胞系上诱导自噬，自噬对病毒复制有利，为了验证体外结果，我们进行了以下体内实验，首先以NDV Herts/33感染1周龄SPF鸡，发现其能够在多种脏器包括：心、肝、脾和肺中诱导LC3的转化。而用自噬抑制药物处理能够降低肺中病毒滴度，减轻肺和肠道的病变，且渥曼青霉素的使用能为1周龄SPF鸡提供40%的保护率。以上实验结果显示NDV在体内也能诱导自噬产生，且自噬对病毒复制有利。本论文以禽细胞为模式细胞证明了细胞自噬在NDV的复制中发挥重要的作用，更重要的是，我们首次以禽为模式生物研究体内状态下自噬与病毒的关系，这为进一步研究自噬与禽源病毒互作及开发新型抗病毒药物提供了线索。