研究背景恶性血液肿瘤(HematoIogical malignancy)主要包括白血病、恶性淋巴瘤以及多发性骨髓瘤,前两类肿瘤发病率排在目前人类恶性肿瘤的前十位。其中白血病在恶性肿瘤所致的死亡率中,占第6位(男)和第8位(女)；儿童及35岁以下成人中,则居第1位,且发病率逐年升高,严重威胁着人类健康和生命。白血病分急性白血病(AL)和慢性白血病(CL),我国AL比CL多见(约5.5：1),其中以急性髓系白血病AML最多(1.62/10万)。急性白血病发病时骨髓中异常的原始细胞及幼稚细胞(白血病细胞)大量增殖并抑制正常造血,广泛浸润肝、脾、淋巴结等各种脏器,表现为贫血、出血、感染和浸润等征象。近年来随着支持治疗的加强、多药联合方案的应用、大剂量化疗和造血干细胞移植(HSCT)的推广,AML患者化疗完全缓解率(CR)可达75%左右,但仍有20%-30%AML经正规化疗后未能获得缓解,称为难治。即使CR后约50%患者会出现复发,一旦复发,患者的预后极差。目前普遍认为白血病难治和复发的原因主要包括：①白血病细胞对凋亡通路的抵制；②白血病细胞高表达多药耐药基因／蛋白；③白血病细胞处于G0期静止状态,对化疗药物不敏感；由于细胞对药物不敏感或耐药,导致大剂量化疗药物的使用,临床上相当一部份患者死于化疗药物的毒副作用而非白血病进展。因此,难治和复发是导致AML治疗失败的最根本的原因,也是目前治疗白血病的一个难题。Eps8 (EGF receptor pathway substrate NO.8)为表皮生长因子受体通路底物8,1993年由Fazioli等人于鼠科纤维母细胞NIH3T3所发现并提出此概念。Eps8广泛分布在不同形态的细胞中,包括间质细胞、上皮细胞,亦有少量存在于造血细胞中。Eps8主要分布于细胞质、核膜及细胞膜周围,是一个接受器型的酪氨酸激酶受体(RTKs),它本身除了受EGFR所磷酸化外,还受其他RTKs磷酸化而激活。Eps8与EGFR结合后,使得细胞的DNA合成和癌化能力增加,此外Eps8也是一个骨架蛋白,Eps8与F-actin及Cortractin结合使细胞骨架重组,细胞膜发生皱襞,促进细胞迁移。Eps8的结构包括磷酸化酪氨酸结合区(phosphotyrosine binding protein, PTB), SH3区和SAM-PNT区(sterile alpha-pointed)。近年来Eps8在实体瘤中的研究表明,Eps8在实体肿瘤中异常高表达,并通过各种调节机制促使肿瘤细胞的迅速生长和迁移,与肿瘤的恶性程度相关,是肿瘤预后不良的指标之一。例如：Eps8通过提高粘附分子(FAK)的表达诱导结肠癌细胞的浸润生长和迁移；Eps8在口腔鳞癌高表达并通过调节Rac1的活性提高癌细胞的侵袭和迁移的能力；Eps8 mRNA在胰腺腺管癌表达显著升高,并与肿瘤转移正相关,Eps8在维持细胞的骨架结构和细胞间的连接起着重要作用,但是,Eps8过度表达则促使细胞恶性转化；Eps8通过降低宫颈癌细胞对化疗药物的敏感性从而影响宫颈癌的预后；光辉霉素(Mithramycin MTM)通过降低Eps8的表达来降低人类上皮癌细胞的增殖和迁移。然而,Eps8在恶性血液肿瘤中的表达如何,国内外尚未见报道。因此,探索Eps8在恶性血液细胞株及恶性血液病中表达情况及研究Eps8在恶性血液细胞株中表达意义显得十分必要。目的以Hela细胞为阳性对照,利用普通RT-PCR检测7种恶性血液肿瘤细胞株He1a、KG1a、K562、HL-60、ARH-77、8226、Raji、Jurkat中Eps8 mRNA的表达情况；构建实时荧光定量PCR检测Eps8基因的方法,进一步利用RQ-PCR (Relative Quantification-PCR)和免疫印迹法(Western Blot)检测7种恶性血液肿瘤细胞株中Eps8表达情况及分析其意义；药物干扰KGla细胞,台盼蓝拒染色法检测药物对KGla细胞的杀伤抑制率,RQ-PCR和Western Blot法检测药物作用浓度及药物作用时间对Eps8表达情况的影响。方法培养He1a、KG1a、K562、HL-60、ARH-77、8226、Raji、Jurkat细胞,利用TRIzol法提取细胞总RNA。选用β-actin作为内参,NCBI里查找eps8基因,参照参考文献及引物设计原则,选定目的基因引物序列,利用普通RT-PCR检测Eps8表达情况,Hela细胞作为阳性对照组,检测健康供着外周血单个核细胞(PBMNCs)及KG1a、K562、HL-60、ARH-77、8226、Raji、Jurkat细胞Eps8表达情况。建立RQ-PCR方法,随机选取样品cDNA模板按10010-1 10-210-3104浓度梯度稀释,用SYBR Green法检验目的基因与内参基因扩增效率,对稀释梯度倍数的log值与ΔCT (ΔCT=CTEps8-CTGAPDH)作直线关系图,斜率小于0.1即可认为两基因扩增效率一致。利用SYBR GreenⅠRQ-PCR法及Western Blot法检测各细胞株Eps8表达差异。利用PE荧光探针法标记KG1a、K562细胞,流式细胞仪检测CD34阳性细胞的表达率。选用蒽环类抗肿瘤药物柔红霉素(DNR)作用KG1a细胞株,台盼蓝拒染法检测DNR对KG1a细胞的杀伤抑制率；(1)以未加药物组为对照组,测DNR浓度分别为0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml24小时对KG1a的杀伤抑制率,并利用RQ-PCR和Western Blot检测对照组和0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.4μg/ml组的Eps8表达情况。(2)以未加药物组为对照组,实验组药物浓度分别为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml,加药后24h、48h、72h测得DNR对KG1a的杀伤抑制率,并利用RQ-PCR法和Western Blot法检测0.1μg/ml、0.4μg/ml组的Eps8表达情况；荧光定量PCR数据应用2-△△CT进行处理,计算各样本平均CT值、ACT值(ΔCt=CtEps8-CtGAPDH)、2-ΔΔCT值(△△Ct=△Ct目的样本一△Ct内参样本),2-ΔΔCT值用于表示目的值相对于参照值的倍数,Western Blot蛋白条带采用ImageJ软件分析,相对蛋白表达量为Eps8光密度值/β-actin光密度值(ODEps8/ODβ-actin)。统计学分析,采用SPSS13.0统计软件进行数据处理,计量数据以均数±标准差x±s)表示。所用统计方法单因素方法分析(One-Way ANOVA),方差齐时,组间多重比较采用LSD方法；方差不齐时,采用Welch检验,组间多重比较采用Dunnett T3检验；析因设计的方差分析,组间多重比较采用SNK方法；P<0.05表示差异有统计学意义。结果总RNA抽样经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,可见28S和18S和5S明显的3条条带,证明抽提的RNA质量完好,无DNA污染。RT-PCR扩增后终产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,在紫外线下观察,可看到与目的片段大小一致的165bp(eps8)、及510bp(β-actin)的电泳条带。两基因扩增效率的判断,结果所得直线y=-0.065x+1.743斜率绝对值为0.065(斜率绝对值<0.1),说明两基因的扩增效率基本相似,实验结果可以用2-△ACT法相对定量分析。即RQ-PCR检验方法成立。各细胞间Eps8 mRNA△CT值总体均数间有显著性差异(F=2082.917,P<0.001),KG1a为BMMNCs的3177.48倍(P<0.001),ARH-77为BMMNCs的377.40倍(P=0.002),8226为BMMNCs的1/10(P=0.025),Raji为BMMNCs的3/100(P=0.001)。其余3种恶性血液细胞株与BMMNCs差异无统计学意义(K562,Jurkat,HL-60)(P=0.831,P=0.960,P=0.969)。同时Western Blot检验的结果示KG1a、ARH-77细胞株中Eps8阳性表达,其余细胞株及BMMNCs组未见阳性条带。实验重复5次,结果一致。KG1a、K562细胞CD34阳性表达率分别为(98.3±1.5)%、(1.3±0.6)%。DNR浓度0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml24小时对KG1a的抑制率分别为(12.36±4.07)%,(26.83±3.68)%,(60.38±3.57)%,(81.44±3.38)%。各浓度对KG1a 24h的杀伤抑制率有显著意义(F=317.11,P<0.001),且随着药物浓度的增加杀伤率提高(P<0.05)。不同药物浓度对Eps8 mRNA的表达组间差异有显著性意义(F=1069.725,P<0.001),药物浓度为0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.4μg/ml组Eps8 mRNA分别为对照组的1/5(P=0.023)、1/20(P=0.011)、1/100(P=0.004),且0.1μg/ml组较0.05μg/ml组Eps8表达下降(P=0.005) 0.4μg/ml较0.05μg/ml组表达下降(P<0.001)。不同药物浓度组间,Eps8蛋白表达有显著性差异(F=99.802,P<0.001),以对照组相比,浓度为0.05g/ml、0.1g/ml、0.4μg/ml组Eps8蛋白表达下调(P<0.001, P<0.001, P<0.001),0.05μg/ml组较0.1μg/ml组Eps8表达下调(P=0.044),0.4μg/ml组较0.1μg/ml组Eps8表达明显下调(P<0.001)。随着药物浓度的增加,DNR对KG1a 24h的杀伤抑制作用增加,Eps8 mRNA和蛋白表达相应降低。药物浓度为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml对KG1a 24h、48h、72h的杀伤抑制率分别(26.91±2.70)%、(45.65±0.54)%、(74.79±1.37)%、(43.15±1.78)%、(61.29±1.97)%、(85.70±1.45)%、(61.28±1.35)%、(88.59±0.76)%、(95.76±0.95)%。DNR作用浓度和作用时间对KG1a细胞的杀伤抑制率、Eps8 mRNA和Eps8蛋白表达均存在交互效应(F=42.33, P<0.001; F=25.916, P<0.001; F=12.786, P=0.000)。且在同一浓度作用下随着作用时间的延长Eps8表达下降(P<0.05),同一作用时间随着药物浓度的增加Eps8表达也下降(P<0.05)。即随着药物浓度的增加和作用时间的延长,DNR对KG1a的杀伤抑制作用增加,Eps8表达下降。结论建立实时荧光定量PCR检测Eps8 mRNA表达方法。2-△△CT分析方法能较好地应用于基因表达相对差异的比较。KG1a及ARH-77细胞株Eps8 mRNA显著高于BMMNCs,8226及Raji细胞株Eps8 mRNA较BMMNCs低表达,其余选用细胞株与BMMNCs的Eps8mRNA表达差异无统计学意义。Eps8蛋白在KG1a及ARH-77阳性表达,其余细胞株与PBMNCs均未检测阳性表达。Eps8在早期造血干细胞来源的细胞株中高表达,推断其对部分恶性血液肿瘤细胞的早期分化起一定作用。DNR作用KG1a细胞发现随药物浓度的增加和作用时间的延长Eps8表达下降,推断DNR对KG1a的杀伤机制之一可能是通过降低Eps8的表达来实现的。