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原发性肝癌是常见的恶性肿瘤,尽管医疗水平不断提高,但其仍然是全球第五位最常见的恶性肿瘤。目前,甲胎蛋白(AFP)仍是肝癌早期诊断中最常用的肿瘤标志物,但仅有30%-40%的患者能够被诊断出来,治疗方式主要通过手术切除、肝移植和介入。由此可见,仅将AFP作为HCC的诊断标志物具有很大局限性,因此,分析肝癌发生发展的相关分子机制,寻求新的肝癌早期诊断生化指标,对改善肝癌患者的诊断治疗具有重要意义。相关研究发现,聚糖在结构和表达水平上的改变与肿瘤细胞间增殖转移的关系密切。唾液酸是一种带有负电荷的九碳单糖,位于糖蛋白和糖脂的寡糖链末端。由于其末端定位性和带负电荷性,使糖链的唾液酸修饰在细胞行为学中发挥重要作用。唾液酸可与次末端的半乳糖、N-乙酰半乳糖胺或糖链上的其他唾液酸以ɑ2,3-、ɑ2,6-或ɑ2,8-方式连接,分别由相应的唾液酸转移酶(sialyltransferases,STs)催化反应。唾液酰基转移酶ST6Gal-I能够通过催化唾液酰基衍生物Neu5Ac与CMP结合形成CMP-Neu5Ac的底物,通过α2,6糖苷键形式与N-聚糖外侧Galβ1-3Glc NAc的二糖单位连接。α2,6唾液酸在不同肿瘤细胞表面上的表达量不同,相关研究发现,唾液酸化糖链结构的异常改变可促使细胞发生癌变。在很多肿瘤组织和细胞中,ST6Gal-I的表达均较高,例如结肠癌、宫颈癌、绒毛膜癌、急性髓性白血病、胃癌以及乳腺癌等。本课题组通过前期研究得知,ST6Gal-I能够正性介导小鼠肝癌细胞的恶性表型。然而,ST6Gal-I在人肝癌细胞生长增殖中的作用及分子机制研究尚不完全明确。目的:1.检测ST6Gal-I在不同临床分期肝癌组织中的表达差异性、以及患者术后随访资料相关性和生存率分析;2.检测ST6Gal-I在肝癌细胞系的表达及定位情况,并筛选获得ST6Gal-I稳定上调的Huh-7单克隆细胞株;3.体外实验细胞水平检测上调/下调ST6Gal-I对肝癌细胞生长、增殖、迁移以及侵袭能力的影响;4.运用小鼠肝癌模型建立和裸鼠体内成瘤实验检测ST6Gal-I在肝癌模型建立过程中的表达变化以及其对体内成瘤能力的影响;5.探讨ST6Gal-I调控肝癌细胞生长、增殖、迁移以及侵袭的分子机制。方法:1.免疫组织化学方法(IHC)检测在正常肝组织,以及不同临床分期肝癌组织中ST6Gal-I的表达差异;2.运用Pearson’s chi-squared和Kaplan–Meier Kaplan–Meier统计学方法分析ST6Gal-I的表达差异与术后随访临床资料相关性以及肝癌患者愈后生存率的相关性;3.Real-time PCR、Western-blot和免疫荧光细胞化学分别检测ST6Gal-I在人正常肝细胞系和肝癌细胞系中的表达及定位情况;4.脂质体法将pc DNA3.1/ST6Gal-I质粒转染到Huh-7细胞株中,通过G418和有限稀释法筛选得到稳定过表达ST6Gal-I的人肝癌Huh-7单克隆细胞株;q PCR、Western Blot、免疫荧光细胞化学和流式细胞术检测ST6Gal-I在稳转细胞Huh-7/ST6Gal-I中的表达情况;5.软琼脂克隆形成、cck-8、流式细胞术、划痕实验和Transwell分别检测上调/下调ST6Gal-I的表达对肝癌细胞生长增殖、迁移和侵袭能力的影响;6.裸鼠体内成瘤实验检测低表达ST6Gal-I后对肝癌细胞在体内成瘤能力的影响;7.利用DEN联合CCl4/乙醇诱导构建小鼠肝癌模型,通过免疫组化和Western Blot方法检测在此过程中ST6Gal-I的表达差异;8.Western Blot和共聚焦免疫荧光细胞化学分析过表达/低表达ST6Gal-I对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白分子的影响。结果:1.与癌旁组织相比,肝癌组织中的ST6Gal-I的表达较高;2.高表达ST6Gal-I与肝癌患者的性别、肿瘤数目、病理分级以及患者生存率有显著统计学差异;3.免疫细胞荧光化学检测发现,ST6Gal-I在核周高尔基体内表达较多,且在Huh-7细胞中表达最低,在MHCC97-H细胞中表达最高;4.上调/下调ST6Gal-I后可明显促进/抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;5.与对照组相比,下调ST6Gal-I的表达后,裸鼠体内的成瘤率能力明显降低,瘤重和瘤体积也明显减小;6.随着肝癌模型的形成,小鼠肝癌组织中ST6Gal-I的表达逐渐增强;7.上调/下调ST6Gal-I可增强/抑制β-catenin、p-GSK-3β、c-Myc、TCF1、TCF4和Cyclin D1等蛋白水平。结论:1.ST6Gal-I在肝癌组织中表达较高,高表达的ST6Gal-I与患者性别、肿瘤数目以及病理分级密切相关,且ST6Gal-I的高表达提示肝癌患者的低生存率;2.筛选得到稳定高表达ST6Gal-I的单克隆Huh-7细胞株,并用实验室保存的下调ST6Gal-I的单克隆细胞株MHCC97-H/sh ST6Gal-I,通过体内体外实验证明,ST6Gal-I表达上调/下调可促进/抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;3.上调/下调ST6Gal-I可通过激活/抑制Wnt/β-catenin信号传导来影响肝癌的发生发展。