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研究背景：
人呼吸道合胞病毒(RSV)是单链负链RNA病毒，属于肺病毒属、副粘病毒科。人类RSV存在作为两个抗原性亚组A和B，其显示全基因组序列差异。RSV基因组具有10个编码11个蛋白质的基因(NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2-1、M2-2和L)。RSV引起的毛细支气管炎是一岁以下儿童最常见的疾病，由于缺乏有效的疫苗和可靠的抗病毒试剂，疾病的负担大于流感的负担。RSV的发病机理复杂多样，对RSV的研究具有重要意义。
环状RNA可通过反向剪接、首尾相连，形成以闭合共价环为特征，不含有5’末端帽子和3’末端polyA尾巴的内源性非编码RNA分子，在各种真核生物中广泛存在。随着高通量测序技术出现和飞速发展，越来越多环状RNA被发现，环状RNA也成为了近年的研究热点。研究表明，环状RNA并非仅仅是剪接的副产物，具有丰富的生物学功能，目前报道较多的功能主要有：竞争性内源RNA(miRNA海绵，即环状RNA拥有多个miRNA结合位点，以此结合miRNA，使其与靶标mRNA的结合受到影响)、调控基因转录、与RNA结合蛋白相互作用和翻译成多肽，环状RNA与多种疾病的发生、发展有密切关系。
在本项研究中，我们以作为对照的未感染RSV的A549细胞(Mock)、感染RSV24小时的A549人肺腺癌细胞(RSV-24h)和感染RSV48小时的A549人肺腺癌细胞(RSV-48h)为研究对象，通过circRNA-seq高通量测序和qRT-PCR方法筛选差异表达的环状RNA分子，发现持续上调的环状RNA。我们在这些上调的环状RNA中筛选了10个上调最显著的候选环状RNA进行了qRT-PCR验证并针对这些环状RNA构建了siRNA文库，发现了hsa_circ_0001426(本文中也称为RP7-05#)对RSV的复制具有抑制作用，因此我们对具体的机制进行了研究。我们的研究发现，hsa_circ_0001426可以通过作为hsa_miR_574-5p的吸附海绵结合hsa_miR_574-5p，从而使hsa_miR_574-5p的靶基因SLC43A3释放而发挥抑制RSV的作用。总之，我们发现了hsa_circ_0001426抑制RSV复制的可能机制，突出了circRNA在RSV感染疾病中的可能作用，为RSV感染相关疾病的检测与治疗提供了新的可能和思路。
研究目的：
通过研究RSV感染引起的circRNAs的鉴定分析及circRNAs对RSV感染的影响的机制探索，为RSV感染相关疾病的检测与治疗提供新的可能和思路。
研究方法：
1.高通量测序筛选差异表达circRNA通过高通量测序检测Mock、RSV-24h与RSV-48h三组A549细胞中差异表达的circRNA，以差异表达大于2倍或小于0.5倍、P值小于0.05的标准筛选差异表达的circRNA。
2.差异circRNA表达水平的验证挑选测序结果中持续上调最明显的10个circRNAs，采用qRT-PCR验证circRNA在Mock、RSV-24h与RSV-48h三组A549细胞中的表达水平。
3.RNA干扰针对10个持续上调最明显的候选环状RNA接头区设计特异性siRNA干扰序列，用LipofectamineTM3000(Invitrogen)瞬时转染RSV感染的A549细胞，培养48h后提取总RNA用qRT-PCR检测siRNA干扰后，对RSV复制是否有影响。
4.RNaseR处理实验1)RNA提取2)RNaseR处理3)RNA纯化4)RNA反转录5)实时定量PCR
5.CircRNA胞浆胞核分布按AmbionPARIS?Kit试剂盒说明书进行操作，分别提取hsa_circ_0001426细胞浆和细胞核RNA，并通过qRT-PCR检测hsa_circ_0001426在胞浆、胞核中的相对表达。
6.RNA免疫共沉淀实验利用免疫共沉淀试剂盒的将结合了miRNA和circRNA的AGO2蛋白复合物拉下来，然后提取其中的RNA，再进行qRT-PCR进行检测。
7.双荧光素酶实验构建hsa_circ_0001426双荧光素酶载体pmiRGLO-hsa_circ_0001426和对照pmiRGLO，使用LipofectamineTM3000(Invitrogen)将双荧光素酶载体和miRNAmimic转染至293-T细胞中，培养24h和48h后，按照Dualluciferasereporterassaysystem(Promega)试剂盒说明书检测荧光变化。
8.蛋白印迹利用western-blot检测RSVF蛋白的表达量变化。
9.统计分析所有试验至少重复3次，数据采用SPSS16.0进行统计分析，试验数据以x-±s表示。两组配对样品之间基因差异表达分析采用配对t检验，两组非配对样品间比较采用两独立样本t检验，两组以上比较采用单因素方差分析，以α=0.05作为检验水准，P＜0.05为差异有统计学意义。
研究结果：
1.高通量测序鉴定RSV感染的A549细胞中的circRNAs及特征分析通过高通量RNA测序技术，发现了53,719个来源于细胞基因组的环状RNA，其中27,296个环状RNA的反向剪切reads数＞1，其中约78%来自CDS区，平均长度为2,386nt，中位数长度为637nt。
2.差异性表达的细胞环状circRNA的表达趋势分析以及功能富集分析对鉴定到的环状RNA进行差异性表达分析，发现2,280个差异性表达的环状RNA。并通过表达趋势分析及GO与KEGG富集分析，发现这些环状RNA可能与天然免疫抗抗病毒相关。
3.持续上调表达的细胞环状RNA的验证在持续表达上调的328个circRNA中选取显著性最高的10个circRNAs，在A549细胞中进行验证，qRT-PCR检测发现这些候选circRNAs在A549细胞感染RSV24h、感染48h中呈现持续表达增高(P＜0.01)。
4.RSV感染的A549细胞中的病毒基因组来源的环状RNA的鉴定与特征分析以及表达趋势分析通过高通量RNA测序技术，发现了1,254个来源于病毒基因组的环状RNA，其中997个环状RNA的反向剪切reads数＞1，其中约1215来自病毒基因组mRNA，平均长度为316nt，中位数长度为262nt。将测序鉴定到的环状RNA进行表达趋势分析，发现其中两个趋势具有统计意义，并对代表的8个病毒circRNAs进行qRT-PCR验证。
5.hsa_circ_0001426可能作为hsa_miR_574-5p分子“海绵”上调SLC43A3的表达，从而发挥抗RSV的作用敲低hsa_circ_0001426可促进RSV的复制，A549细胞浆细胞核RNA分离实验发现hsa_circ_0001426主要分布于细胞浆，生物信息学分析及AGO2免疫共沉淀实验证明hsa_circ_0001426很可能发挥miRNA分子海绵作用，而hsa_miR_574-5p对RSV的复制也有促进作用，从而推测hsa_circ_0001426可能作为hsa_miR_574-5p“海绵”解除hsa_miR_574-5p对其靶基因SLC43A3的抑制，参与抗RSV复制的过程。
研究结论：
1.表达趋势分析中具有统计学意义的circRNAs1089个进行GO及KEGG富集分析，发现这些circRNAs可能与天然免疫抗病毒相关。
2.8个代表的病毒环状RNA在A549细胞和Hep2细胞中在RSV感染时均上调，提示这些病毒环状RNA在病毒感染的基本过程中起着重要作用。
3.敲低细胞环状hsa_circ_0001426可促进RSV复制，其可能通过竞争结合hsa_miR_574-5p而上调SLC43A3的表达的机制发挥作用。
人呼吸道合胞病毒(RSV)是单链负链RNA病毒，属于肺病毒属、副粘病毒科。人类RSV存在作为两个抗原性亚组A和B，其显示全基因组序列差异。RSV基因组具有10个编码11个蛋白质的基因(NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2-1、M2-2和L)。RSV引起的毛细支气管炎是一岁以下儿童最常见的疾病，由于缺乏有效的疫苗和可靠的抗病毒试剂，疾病的负担大于流感的负担。RSV的发病机理复杂多样，对RSV的研究具有重要意义。
环状RNA可通过反向剪接、首尾相连，形成以闭合共价环为特征，不含有5’末端帽子和3’末端polyA尾巴的内源性非编码RNA分子，在各种真核生物中广泛存在。随着高通量测序技术出现和飞速发展，越来越多环状RNA被发现，环状RNA也成为了近年的研究热点。研究表明，环状RNA并非仅仅是剪接的副产物，具有丰富的生物学功能，目前报道较多的功能主要有：竞争性内源RNA(miRNA海绵，即环状RNA拥有多个miRNA结合位点，以此结合miRNA，使其与靶标mRNA的结合受到影响)、调控基因转录、与RNA结合蛋白相互作用和翻译成多肽，环状RNA与多种疾病的发生、发展有密切关系。
在本项研究中，我们以作为对照的未感染RSV的A549细胞(Mock)、感染RSV24小时的A549人肺腺癌细胞(RSV-24h)和感染RSV48小时的A549人肺腺癌细胞(RSV-48h)为研究对象，通过circRNA-seq高通量测序和qRT-PCR方法筛选差异表达的环状RNA分子，发现持续上调的环状RNA。我们在这些上调的环状RNA中筛选了10个上调最显著的候选环状RNA进行了qRT-PCR验证并针对这些环状RNA构建了siRNA文库，发现了hsa_circ_0001426(本文中也称为RP7-05#)对RSV的复制具有抑制作用，因此我们对具体的机制进行了研究。我们的研究发现，hsa_circ_0001426可以通过作为hsa_miR_574-5p的吸附海绵结合hsa_miR_574-5p，从而使hsa_miR_574-5p的靶基因SLC43A3释放而发挥抑制RSV的作用。总之，我们发现了hsa_circ_0001426抑制RSV复制的可能机制，突出了circRNA在RSV感染疾病中的可能作用，为RSV感染相关疾病的检测与治疗提供了新的可能和思路。
研究目的：
通过研究RSV感染引起的circRNAs的鉴定分析及circRNAs对RSV感染的影响的机制探索，为RSV感染相关疾病的检测与治疗提供新的可能和思路。
研究方法：
1.高通量测序筛选差异表达circRNA通过高通量测序检测Mock、RSV-24h与RSV-48h三组A549细胞中差异表达的circRNA，以差异表达大于2倍或小于0.5倍、P值小于0.05的标准筛选差异表达的circRNA。
2.差异circRNA表达水平的验证挑选测序结果中持续上调最明显的10个circRNAs，采用qRT-PCR验证circRNA在Mock、RSV-24h与RSV-48h三组A549细胞中的表达水平。
3.RNA干扰针对10个持续上调最明显的候选环状RNA接头区设计特异性siRNA干扰序列，用LipofectamineTM3000(Invitrogen)瞬时转染RSV感染的A549细胞，培养48h后提取总RNA用qRT-PCR检测siRNA干扰后，对RSV复制是否有影响。
4.RNaseR处理实验1)RNA提取2)RNaseR处理3)RNA纯化4)RNA反转录5)实时定量PCR
5.CircRNA胞浆胞核分布按AmbionPARIS?Kit试剂盒说明书进行操作，分别提取hsa_circ_0001426细胞浆和细胞核RNA，并通过qRT-PCR检测hsa_circ_0001426在胞浆、胞核中的相对表达。
6.RNA免疫共沉淀实验利用免疫共沉淀试剂盒的将结合了miRNA和circRNA的AGO2蛋白复合物拉下来，然后提取其中的RNA，再进行qRT-PCR进行检测。
7.双荧光素酶实验构建hsa_circ_0001426双荧光素酶载体pmiRGLO-hsa_circ_0001426和对照pmiRGLO，使用LipofectamineTM3000(Invitrogen)将双荧光素酶载体和miRNAmimic转染至293-T细胞中，培养24h和48h后，按照Dualluciferasereporterassaysystem(Promega)试剂盒说明书检测荧光变化。
8.蛋白印迹利用western-blot检测RSVF蛋白的表达量变化。
9.统计分析所有试验至少重复3次，数据采用SPSS16.0进行统计分析，试验数据以x-±s表示。两组配对样品之间基因差异表达分析采用配对t检验，两组非配对样品间比较采用两独立样本t检验，两组以上比较采用单因素方差分析，以α=0.05作为检验水准，P＜0.05为差异有统计学意义。
研究结果：
1.高通量测序鉴定RSV感染的A549细胞中的circRNAs及特征分析通过高通量RNA测序技术，发现了53,719个来源于细胞基因组的环状RNA，其中27,296个环状RNA的反向剪切reads数＞1，其中约78%来自CDS区，平均长度为2,386nt，中位数长度为637nt。
2.差异性表达的细胞环状circRNA的表达趋势分析以及功能富集分析对鉴定到的环状RNA进行差异性表达分析，发现2,280个差异性表达的环状RNA。并通过表达趋势分析及GO与KEGG富集分析，发现这些环状RNA可能与天然免疫抗抗病毒相关。
3.持续上调表达的细胞环状RNA的验证在持续表达上调的328个circRNA中选取显著性最高的10个circRNAs，在A549细胞中进行验证，qRT-PCR检测发现这些候选circRNAs在A549细胞感染RSV24h、感染48h中呈现持续表达增高(P＜0.01)。
4.RSV感染的A549细胞中的病毒基因组来源的环状RNA的鉴定与特征分析以及表达趋势分析通过高通量RNA测序技术，发现了1,254个来源于病毒基因组的环状RNA，其中997个环状RNA的反向剪切reads数＞1，其中约1215来自病毒基因组mRNA，平均长度为316nt，中位数长度为262nt。将测序鉴定到的环状RNA进行表达趋势分析，发现其中两个趋势具有统计意义，并对代表的8个病毒circRNAs进行qRT-PCR验证。
5.hsa_circ_0001426可能作为hsa_miR_574-5p分子“海绵”上调SLC43A3的表达，从而发挥抗RSV的作用敲低hsa_circ_0001426可促进RSV的复制，A549细胞浆细胞核RNA分离实验发现hsa_circ_0001426主要分布于细胞浆，生物信息学分析及AGO2免疫共沉淀实验证明hsa_circ_0001426很可能发挥miRNA分子海绵作用，而hsa_miR_574-5p对RSV的复制也有促进作用，从而推测hsa_circ_0001426可能作为hsa_miR_574-5p“海绵”解除hsa_miR_574-5p对其靶基因SLC43A3的抑制，参与抗RSV复制的过程。
研究结论：
1.表达趋势分析中具有统计学意义的circRNAs1089个进行GO及KEGG富集分析，发现这些circRNAs可能与天然免疫抗病毒相关。
2.8个代表的病毒环状RNA在A549细胞和Hep2细胞中在RSV感染时均上调，提示这些病毒环状RNA在病毒感染的基本过程中起着重要作用。
3.敲低细胞环状hsa_circ_0001426可促进RSV复制，其可能通过竞争结合hsa_miR_574-5p而上调SLC43A3的表达的机制发挥作用。