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喹诺酮类药物及消毒剂在人类及动物的临床使用中扮演着举足轻重的角色,但各类细菌对喹诺酮类药物及消毒剂的耐药问题已日益严峻,不同地区的不同菌群对喹诺酮类药物及消毒剂的耐药率也呈逐年上升的趋势,有关大肠埃希菌对喹诺酮类药物和季铵盐消毒剂的耐药机制已有大量报道,同时也有报道表明细菌对喹诺酮类药物和消毒剂之间存在交叉耐药,但交叉耐药变迁的分子机制还未见报道。本试验主要分别以不同浓度恩诺沙星和苯扎溴铵不同频次作用大肠埃希菌获得的不同耐药表型的菌株为研究对象,进行交叉耐药变迁的分子机制研究,旨在为临床合理使用抗菌药和消毒剂提供理论基础。1、恩诺沙星/苯扎溴铵诱导大肠埃希菌ATCC25922获得不同耐药表型菌株采用微量肉汤法测定恩诺沙星/苯扎溴铵对大肠埃希菌ATCC25922的MIC。采用多步法以不同浓度(1/2×MIC、1×MIC……128×MIC)恩诺沙星/苯扎溴铵分别多次对大肠埃希菌ATCC25922进行体外诱导,并检测每一步处理后两药对受试菌株MIC的变化情况。结果:通过1/2×MIC、1×MIC……128×MIC浓度恩诺沙星对大肠埃希菌ATCC25922体外诱导各20代,得到恩诺沙星MIC增加8、16、32、64、128倍的耐药株5株:E8、E16、E32、E64、E128;通过1/2×MIC、1×MIC……16×MIC浓度苯扎溴铵对大肠埃希菌ATCC25922体外诱导各50代,得到苯扎溴铵MIC增加1、2、4、8、16倍的耐药株4株:B2、B4、B8、B16。结论:不同浓度恩诺沙星和苯扎溴铵诱导大肠埃希菌后可得到不同耐药表型菌株,耐恩诺沙星株较耐苯扎溴铵株更容易获得,体外诱导耐苯扎溴铵株不能产生高倍耐药。2、不同耐药表型菌株对恩诺沙星和苯扎溴铵交叉耐药性分析采用微量肉汤法测定恩诺沙星对B2、B4、B8、B16的MIC和苯扎溴铵对E8、E16、E32、E64、E128的MIC。结果:B2、B4、B8、B16对恩诺沙星的MIC分别增加4、8、16、32倍;E8、E16、E32、E64、E128对苯扎溴铵的MIC分别增加4、8、16、16、64倍。结论:某一药物诱导所得不同耐药表型菌株对另一药物也呈不同程度耐药,且耐药性随耐药株对某药物耐药性的增加而增加。3、恩诺沙星/苯扎溴铵耐药变迁的分子机制研究检测E8、E16、E32、E64、E128耐药基因gyr A和gyr B、par C和par E、acr A、acr B、tol C、acr Z诱导前后的变异情况,检测该5株菌acr A、acr B、tol C、acr Z、emr A/B、mdf A诱导前后表达量变化情况以及质粒耐药基因qnr A、qnr B、qnr C、qnr D、qnr S、aac-6’-Ib-cr、qep A/B诱导前后检出率变化情况;检测B2、B4、B8、B16耐药基因teh A/B、ydg E/F、acr A、acr B、tol C、acr Z诱导前后的变异情况及sug E、teh A/B、ydg E/F、acr A、acr B、tol C、acr Z、emr A/B、emr E、mdf A诱导前后表达量的变化情况。结果:恩诺沙星诱导耐药株质粒耐药基因的检出率为0;耐药基因gyr A和gyr B、par C和par E、teh A/B、ydg E/F、acr A、acr B、tol C、acr Z中除teh A/B、ydg E/F和acr Z外均有不同程度的碱基和氨基酸序列突变,且突变位点随菌株耐药性的增加而增多;基因sug E、teh A/B、ydg E/F、acr A、acr B、tol C、emr A/B、emr E、mdf A的表达量都随着耐药性的增加而表现为显著和极显著增加,acr Z显著减少。结论:诱导所得耐药菌株耐药表型与各耐药基因的突变与表达量变化密切相关。4、恩诺沙星和苯扎溴铵交叉耐药变迁的分子机制研究检测诱导E8、E16、E32、E64、E12、B2、B4、B8、B16耐药基因acr A、acr B、tol C、acr Z诱导前后的变异情况和acr A、acr B、tol C、acr Z、emr A/B、mdf A表达量的变化情况。结果:两类耐药菌株中除acr Z基因未发生氨基酸突变外,其他基因都有相同碱基和氨基酸序列突变;7个基因除acr Z基因表达量显著减少外,其他基因都显著或极显著增加。且在两种药物诱导所得株中,acr A基因的表达量都表现为随着耐药表型的每一次改变都显著增加,而其他基因则表现为1次或几次的显著增加。结论:大肠埃希菌对恩诺沙星和苯扎溴铵的交叉耐药变迁是由各耐药基因的共同作用引起的,在被检基因中acr A基因扮演着最为重要的角色,提示acr A基因可能是引起大肠埃希菌对恩诺沙星和苯扎溴铵交叉耐药变迁的主要因素。