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柑橘青、绿霉病是全世界柑橘类水果贮运期间发生最严重的真菌病害,由它们引起的果实霉烂已给柑橘产业造成了巨大的经济损失。柑橘青霉病菌意大利青霉（Penicillum italicum）比绿霉病菌指状青霉（P.digitatum）更适宜低温环境（低于4℃）生长和发育,因此青霉病是柑橘采后低温贮运早期发生的主要病害。早期青霉病引起果实腐烂放热,提高果堆温度,为绿霉病爆发创造了条件。所以,意大利青霉的防治对柑橘产业的发展具有重要的经济影响。柑橘青、绿霉病防治主要采用甾醇14α-去甲基化酶抑制剂（14-α-demethylation inhibitors,DMIs）类型的唑类药物如咪鲜胺和抑霉唑。然而,过度使用唑类DMIs药物导致柑橘病原真菌的抗药性问题日益突出,相关的抗性机制研究备受重视。目前,柑橘绿霉菌抗药机制研究较多,证明其DMIs抗性基因包括甾醇生物合成途径关键基因CYP51以及转运蛋白基因。但是,意大利青霉抗性菌株报道极少,尤其缺乏DMIs高抗菌株,其耐受唑类DMIs药物的分子机制尚不清楚。本研究从国内主要柑橘产区采集的125份霉烂柑橘样品中,分离、鉴定了多株具有唑类DMIs抗性的意大利青霉。转录组解析揭示了意大利青霉抗药性相关基因及其代谢途径。缺失突变意大利青霉ku70构建高效的基因敲除系统,在高抗株ku70缺失突变体的基础上构建了抗性基因（药泵蛋白基因ABCG1和甾醇调控元件结合蛋白基因sreA）的缺失和回补突变株。功能实验证明ABCG1参与药物转运介导唑类DMIs抗性,而sreA参与调控意大利青霉的唑类DMIs抗药性。主要研究结果如下:1.意大利青霉的分离鉴定及其高抗菌株筛选根据菌落形态和ITS聚类,本研究从霉烂柑橘表皮分离的146个菌株中鉴定了 91株指状青霉（P.digitatum）、33株意大利青霉（P.italicum）和20株皮落青霉（P.crustosum）。咪鲜胺抗性实验表明:约36.4%的意大利青霉和38.5%的指状青霉的药物耐受浓度大于0.5 mg/L;全部20株皮落青霉的药物耐受浓度超过5.0 mg/L。咪鲜胺EC50测定筛选到3株意大利青霉唑类DMIs抗性株,其中YN1为高抗株。YN1对三种唑类DMIs（咪鲜胺、抑霉唑和三唑酮）均高抗,EC50分别为30.1、12.2和1035.8 mg/L。此外,本研究从35株柑橘采后病原菌中分离鉴定了 4种青霉真菌病毒,其中PiCV1、PcCV1和PdPGV1为首次报道。2.咪鲜胺敏感性差异意大利青霉菌株的转录组解析转录组分析咪鲜胺诱导高抗株YN1和敏感株HN1的基因转录量变化,筛选意大利青霉的唑类DMIs抗性相关基因。GO和KEGG功能富集显示,咪鲜胺诱导高抗株后,与抗性密切相关的上调表达差异基因共15个。包括（1）特定的2个ABC和4个MFS药泵蛋白基因大幅度上调表达,说明胞内药物外排增强;（2）唑类药物靶标CYP51基因及其上、下游的甾醇代谢通路基因ERG2和ERG6的转录本丰度显著升高,表明药物代谢和细胞膜修复过程增强;（3）MAPK途径的slt2、hog1基因和钙信号通路CaMK基因的转录量也明显提高,说明唑类药物诱导了细胞膜或细胞壁的应激反应。qPCR验证这些基因的表达与转录组结果趋势一致,表明意大利青霉唑类DMIs抗性机制与甾醇生物合成途径基因、药泵蛋白基因、MAPK和钙信号途径基因关系密切。3.意大利青霉高效基因敲除系统的建立为了构建高效的意大利青霉基因敲除系统,本研究克隆、鉴定了意大利青霉非同源末端连接（Non-homologous end joining,NHEJ）修复途径的核心因子编码基因ku70。重叠延伸PCR拼接包含ku70上、下游2.0 kb侧翼同源序列和neo cassette的敲除盒,转化意大利青霉原生质体,通过同源重组替换获得意大利青霉的高效基因打靶受体菌株Δku70。野生型亲本菌株与Δku70突变体在营养生长、菌落形态、盐（NaCl、KCl）与H2O2胁迫、抗生素（潮霉素B、萎锈灵和氯嘧磺隆）和唑类DMIs（咪鲜胺、抑霉唑、三唑酮）敏感性以及毒力表型等方面均无明显差异。mfs6和pksP基因敲除实验证明:ku70缺失显著提高了意大利青霉的基因打靶（敲除）效率。建立的意大利青霉高效基因敲除系统为后续抗性基因功能研究奠定了良好基础。4.意大利青霉ABCG1基因克隆及其功能鉴定根据转录组抗药相关候选基因ABC1序列,克隆鉴定了意大利青霉ABC超家族的第一个转运蛋白基因ABCG1。唑类DMIs高抗株YN1的ABCG1基因全长gDNA和cDNA编码区分别为4527 bp和4455 bp,包含1个内含子;编码蛋白包含1484个氨基酸残基,属于（NBD-TMD6）2型跨膜转运蛋白。意大利青霉ABCG1缺失和回补突变体构建与表型分析显示,敲除ABCG1不影响意大利青霉在PDA上的营养生长、菌落形态和柑橘表皮的毒力。然而,ΔABCG1的咪鲜胺和抑霉唑EC50约为亲本菌株的60.5%和63.9%（19.9和10.6 mg/L）,回补菌株的抗药水平介于亲本菌株和ΔABCG1之间。亲本菌株、ΔABCG1和回补菌株对三唑酮的敏感性没有显著差异。证明多向抗药性（Pleiotropic drug resistance,PDR）转运蛋白ABCG1参与介导意大利青霉的唑类DMIs抗性,其专一性DMIs底物可能是咪唑类而非三唑类。5.意大利青霉sreA在唑类DMIs抗性调控中的功能甾醇调控元件结合蛋白（Sterol regulatory element binding protein,SREBP）是一类碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix,bHLH）转录因子,调控真核生物厌氧胁迫、唑类药物抗性和毒力等多种细胞响应。为了研究意大利青霉唑类DMIs抗性相关基因的表达调控关系,本研究克隆鉴定了意大利青霉SREBP编码基因sreA。PisreA基因全长3111 bp,其ORF编码SreA蛋白包含1036个氨基酸残基,N端和C端分别为SreA家族典型的bHLH和DUF2014结构域,428-550和560-579区域形成二次跨膜结构域。采用基因敲除和回补构建了意大利青霉高抗株YN1的sreA缺失和回补突变体。表型分析表明,sreA敲除不影响YN1在PDA上的正常生长和菌落形态,但是显著减弱其在柑橘表皮的产孢和侵染扩散能力;说明sreA是意大利青霉的毒力基因。唑类DMIs抗性实验表明,ΔsreA突变体对咪鲜胺、抑霉唑和三唑酮的抗性急剧降低,接近敏感株水平;qPCR分析表明sreA参与调控CYP51靶标、ABC和MFS转运蛋白的基因转录。综上所述,本研究分离鉴定了 144株柑橘青霉病原菌,从33株意大利青霉中筛选到唑类DMIs高抗株YN1。转录组解析揭示甾醇生物合成途径基因、药泵蛋白基因、MAPK和钙信号途径基因参与意大利青霉的唑类DMIs抗性。成功构建了意大利青霉高效基因敲除系统,基于此系统研究了意大利青霉ABCG1和SreA的功能;证明ABCG1参与咪唑类DMIs抗真菌剂转运,而SreA参与调控唑类DMIs抗性相关的靶标CYP51和转运蛋白ABC、MFS基因的转录表达。为深入认识意大利青霉的唑类DMIs抗性机制提供了理论依据。