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胚胎是一个新生命的开始,胚胎发生和发育受到极其严格且精细的调控,以保证传宗接代正常进行。无论动物还是植物,胚胎都被母体组织层层包裹,多年来的研究揭示了胚胎发育过程中周围母体组织形成的微环境对胚胎发育至关重要,特别是早期胚胎发育极其依赖于这种微环境所传递出的发育信号。对动物胚胎的研究表明,母体-胚胎间存在着复杂的信号交流。母体组织发育缺陷或母源性信号分子异常会导致胚胎发育异常或胎源性疾病。植物胚柄连接着母体和胚胎,不仅支撑和固定胚胎的位置,还为其运输必需的营养物质和激素,类似于哺乳动物脐带的作用,因此是研究植物胚胎与母体组织相互作用的良好模型。但与动物的脐带不同,植物的胚柄在胚胎发育早期就开始降解,由此断开了母体与胚胎的直接信号交流。植物胚胎这种与母体组织联系的实时阻断是如何调控的,其分子机制是什么,是我们本课题所关注的科学问题。早期实验揭示了Nt CYS-Nt CP14是一对调控胚柄细胞程序性死亡（PCD）启动的分子开关。以此为切入点,我们以烟草为模式植物,系统地研究了调控Nt CYS-Nt CP14介导的胚柄PCD的信号转导途径、信号本质、以及其信号来源,从而揭示了母体通过赤霉素（GA）信号途径调控胚柄细胞程序性死亡的分子机制。主要研究结果如下:1.发现直接调控Nt CYS的转录因子Nt CRF1。证实Nt CRF1能够直接结合在Nt CYS的启动子上。其中,Nt CRF1与Nt CYS启动子上第三个AATTT基序的结合能力最强。Nt CRF1能形成同源二聚体,可能像其他GRAS蛋白在体内以二聚体的形式行使结合DNA的功能。2.揭示Nt CRF1和Nt CYS在胚柄基部细胞共表达并具有相似的动态变化。p Nt CRF1::Nt CRF1-GFP株系观察结果显示,从2胞原胚到32细胞胚发育过程中,Nt CRF1蛋白在单细胞胚柄、二细胞胚柄、四细胞胚柄的基部细胞中的变化趋势和Nt CYS蛋白的动态变化一致,即:2胞原胚和4胞原胚时期中有较高的表达水平;当胚胎发育到8细胞胚胎时期,Nt CRF1显著降低;到32细胞胚时期,Nt CRF1基本消失。3.证实Nt CRF1能在体内调控Nt CYS的表达及胚柄PCD的起始。Nt CRF1下调和敲除株系均能下调Nt CYS的m RNA表达水平。相反,过表达Nt CRF1则能上调Nt CYS的表达水平。同时,利用TUNEL实验检测Nt CRF1下调株系及突变体中胚胎发育情况,发现在二细胞原胚时期胚柄就开始启动PCD,进一步证明Nt CRF1是Nt CYS的直接调控因子,也是胚柄PCD发生的关键调控因子。此外,胚柄的提前降解也导致了胚胎发育模式的改变和降低种子育性。4.揭示NtCRF1作为DELLA蛋白行使响应GA的功能。其一,通过NCBI序列比对发现,Nt CRF1具有DELLA蛋白的序列特征,及蛋白N端有一个DELLA结构域,C端具有高度保守的GRAS结构域。其二,Nt CRF1响应活性GA。在p Nt CRF1::Nt CRF1-GFP株系中,活性GA处理幼胚,Nt CRF1-GFP荧光减弱或消失。GA合成抑制剂（PAC）体外处理种子至32细胞胚时期,胚柄中Nt CRF1-GFP信号依然存在。其三,Nt CRF1依赖活性GA与GA受体Nt GID1相互作用。5.发现具生物活性的GA4在胚柄PCD发生之前适时地升高。RT-PCR结果显示GA合成关键基因GA3ox在胚柄PCD之前表达水平瞬间升高后回落,这可能会促使活性GA的瞬间升高。同时,GA示踪GPS1也显示在胚柄PCD之前存在一个瞬间升高的过程。通过测量不同时期种子中各GA的含量发现,在胚柄PCD之前检测不到GA1,只能检测到GA4,与之前的结果一致。表明GA4在胚柄PCD之前瞬间升高。6.证实活性GA能在体外诱导胚柄PCD提前启动。在胚胎体外胚胎培养系统中,用具有生物活性的GA4处理野生型2细胞原胚,通过PI-FDA和TUNEL检测发现GA能诱导胚柄PCD的提前启动。同时,GA能在体外降低Nt CYS的表达水平。这表明,GA能够通过下调Nt CYS的表达水平来触发胚柄PCD。7.发现触发胚柄PCD的GA来源于母体组织。2胞原胚转录组分析数据和4胞原胚RT-PCR检测结果,都证实GA合成相关基因不在幼胚中表达,但是参与GA信号转导的基因有表达。p Nt GA3ox::H2B-GFP转基因株系观察显示,在8细胞胚之前,GA合成来源于母体组织（种皮）,受精后GA在整个种皮都有合成,在胚柄PCD之前,逐渐在珠孔端特异表达。GPS1也显示了同样的GA极性分布。在8细胞胚之后,胚体表达GA3ox,但是,胚柄依然没有表达。GPS1和Nt CRF1-GFP的表达模式说明,在胚柄中GA是从基部细胞开始升高的,然而基部细胞连接着胚胎和母体组织。综上,GA来源于母体组织,从胚柄基部细胞进入胚柄并触发PCD的起始。8.异位表达GA合成关键酶GA3ox1能提前胚柄PCD发生。利用种子各组织特异型启动子（种皮、胚乳、胚胎和珠被绒毡层）异位表达Nt GA3ox1。其中,在种皮、胚乳和胚胎异位表达GA3ox1都无法影响Nt CYS表达水平变化,但在珠被绒毡层（与胚柄基部细胞直接相连的组织）异位表达GA3ox1能下调Nt CYS的表达,并且引发胚胎PCD提前启动,最终导致胚胎败育。这进一步证实,改变母体组织中GA的原有时空分布,能影响胚柄PCD的发生。综上所述,我们揭示了母体组织通过GA-GID1-CRF1-CYS-CP14信号转导途径适时地调控胚柄PCD的发生。这一发现填补了植物胚柄PCD上游调控分子机制的空白,首次明确地揭示了一条较为完整的母体-胚胎直接信号交流途径,对认识母体对胚胎发育的作用机制具有重要意义。