论文部分内容阅读
背景和目的:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,吸烟和空气污染等多种危险因素与肺癌的发生密切相关。尽管目前在外科手术、放射治疗和化学治疗方面取得了显著进展,但肺癌的生存率仍然很低。肺癌包括两种类型:SCLC(small cell lung cancer,小细胞肺癌)和NSCLC(non-small cell lung cancer,非小细胞肺癌)。NSCLC导致80%以上的肺癌。目前对NSCLC的早期生物标志物的研究仍有限,早期诊断困难,大多数NSCLC患者在晚期才被诊断,错过手术的最佳时期而死亡。因此,对NSCLC肿瘤发生机制的研究对于NSCLC的早期预后和新的治疗方法的发展都是至关重要的。Micro-RNAs(miRNAs)是一种约19-25 bp的非编码RNA,通过抑制mRNA的稳定性或翻译来抑制基因的表达。最近的研究表明许多miRNA在肿瘤组织中表现出异常的表达,这表明miRNA可能参与肿瘤的发生。尽管人类基因组编码了400多种小RNA,但许多小RNA的功能仍然未知。研究miRNA在NSCLC进展中的作用将是富有成效的。在本研究中,我们发现在NSCLC样本中,miR-520b的表达明显上调,miR-520b水平与Hedgehog(Hh)通路活性呈正相关,因此我们推测miR-520b通过Hh通路调控NSCLC发展。本论文将研究miR-520b在NSCLC发展中的作用及其调控机制,确定miR-520b的靶基因,验证miR-520b是否通过Hh通路来调控NSCLC发展,并确定miR-520b调控NSCLC细胞Hh通路的分子机制。本论文将为NSCLC的预防以及治疗提供新的理论基础和新的方向。材料和方法:1.NSCLC中miR-520b的表达及其对NSCLC发展的影响(1)通过荧光定量PCR分析12对NSCLC肿瘤样品及配对的癌旁样品的miR-520b的表达;(2)miR-520b模拟物和miR-520b抑制剂转染A549和H1299细胞后用MTT方法检测细胞增殖能力;(3)miR-520b模拟物和miR-520b抑制剂转染A549细胞后用划痕实验检测细胞迁移能力;(4)miR-520b模拟物和miR-520b抑制剂转染A549细胞后用transwell实验检测细胞侵袭能力。2.miR-520b靶基因的确定(1)通过生物信息学分析网址(www.targetsan.org)预测miR-520b的靶基因;(2)通过westernblotting检测12对NSCLC癌样品及配对的癌旁样品的SPOP蛋白的表达量;(3)TCGA数据分析miR-520b的表达水平及NSCLC癌症患者的生存率的关系;(4)miR-520b模拟物和miR-520b抑制剂转染A549细胞后用western blotting检测内源性和外源性SPOP蛋白的表达量;(5)MTT方法检测转染了SPOPsiRNA或者Fg-SPOP的细胞的增殖能力;(6)用CRISPR/CAS9技术来构建SPOP敲除的A549细胞,miR-520b模拟物或miR-520b抑制剂转染野生型和SPOP敲除的A549细胞后,用荧光素酶报告分析miR-520b和野生型SPOP的3’端UTR或突变型SPOP的3’端UTR的相互作用。3.miR-520b通过Hh通路调控NSCLC发展(1)通过q-PCR检测NSCLC肿瘤样品和配对的正常癌旁组织样品中GLI2和BCL2的相对mNRA表达水平;(2)用miR-520b模拟物或miR-520b抑制剂处理A549细胞后通过Westernblotting检测Hh通路、Wnt通路和Hippo通路特征蛋白的表达;(3)环胺处理A549细胞后进行MTT实验和transwell分析;(4)siRNA敲低A549细胞GLI2/3后进行MTT和划痕实验检测。4.miR-520b调控NSCLC细胞Hh通路的分子机制(1)通过Co-IP实验验证SPOP和GLI2/3的相互作用;(2)通过Co-IP实验验证SPOP的N端的MATH结构域是否结合GLI2/3;(3)A549细胞转染各种带Fg标签的SPOP突变体(Y87N、F102C、S119N、F125L、K129E、W131G、F133V、K134N)、WTFg-SPOP以及CMV-Fg对照质粒后,通过westernblotting和Co-IP实验检测GLI2/3的泛素化;(4)A549细胞和H1299细胞转染各种带Fg标签的SPOP突变体(Y87N、F102C、S119N、F125L、K129E、W131G、F133V、K134N)、WTFg-SPOP以及CMV-Fg对照质粒后,通过MTT方法检测各细胞增殖能力。结果:1.NSCLC中miR-520b的表达及其对NSCLC发展的影响(1)NSCLC肿瘤样本中miR-520的表达上调;(2)miR-520b促进NSCLC细胞增殖;(3)miR-520b促进NSCLC细胞迁移;(4)miR-520b促进NSCLC细胞侵袭。2.miR-520b靶基因的确定(1)生物信息学分析预测miR-520b的靶基因是SPOP;(2)NSCLC肿瘤样品中SPOP表达下调;(3)TCGA数据表明NSCLC癌症患者的生存率与SPOP表达正相关;(4)miR-520b调控SPOP表达;(5)SPOP调控NSCLC细胞增殖;(6)miR-520b靶向SPOP调控NSCLC细胞增殖和侵袭。3.miR-520b通过Hh通路调控NSCLC发展(1)NSCLC肿瘤样品的Hh通路特征基因GLI1和BCL2表达上调;(2)miR-520b可特异性激活NSCLC细胞中的Hh通路;(3)miR-520b通过Hh通路促进NSCLC细胞增殖和侵袭;(4)miR-520b通过GLI2/3促进NSCLC细胞增殖和迁移。4.miR-520b调控NSCLC细胞Hh通路的分子机制(1)SPOP和GLI2/3的相互作用;(2)SPOP的N端的MATH结构域和GLI2/3相互作用;(3)SPOP促进GLI2/3的泛素化降解;(4)miR-520b通过调控SPOP-GLI2/3轴调控NSCLC细胞增殖。结论:1.miR-520b在NSCLC中上调并在起着致癌作用;2.SPOP是miR-520b的靶向基因;3.SPOP激活NSCLC细胞的Hh通路;4.miR-520b通过GLI2/3调控NSCLC细胞的增殖和侵袭;5.SPOP通过对GLI2/3的泛素化使其降解,调控Hh通路。