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目的:涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC),是最常见的涎腺恶性肿瘤之一,该肿瘤具有侵袭性强、浸润性生长,早期沿神经及血管向远处扩展和转移等特征。肿瘤常经血行转移至肺而严重危害人类健康。目前寻找可口服、副作用小、可长期应用的抗肿瘤药物一直是口腔医学界研究的热门课题之一。多被银莲花(Anemone Raddeanin Regel,ARR)是中药毛茛科植物的干燥根茎,药材味辛、热、有毒、归脾经,具有祛风湿、消肿痛之功效。多被银莲花提取物总皂甙(Anemone Raddeanin Regel Extracts,ARRE)是多被银莲花经水解和溶剂萃取而来。药理活性研究发现多被银莲花总皂甙有抗肿瘤、镇痛、镇静及抗惊厥作用。多被银莲花总皂甙体外实验结果显示水溶性总皂甙对兔脑c AMP-PDE的生长具有明显的抑制效果,最高可达61.3%。另有体外实验表明多被银莲花总皂甙能够明显抑制人癌细胞KB、HCT-8、MCF-7/WT和MCF-7/ADR细胞株的生长。而在小鼠的动物实验中多被银莲花总皂甙对肉瘤S180、肝癌H22和艾氏腹水癌EAC具有明显的抑瘤效果,其抑瘤率分别达68.1%、62.5%、69.3%。目前关于多被银莲花提取物总皂甙对腺样囊性癌癌细胞作用的研究鲜有报道。本实验采用水解和溶剂萃取的方法,从中药多被银莲花中提取分离得到总皂甙。通过对体外培养的人涎腺腺样囊性癌高肺转移株(Adenoid cystic carcinoma of high pulmonary metastatic,ACC-M)经不同浓度、不同时间的多被银莲花总皂甙处理后,采用MTT法、倒置相差显微镜观察法、吉姆萨染色法、Annexin-V-FITC和PI双标记活细胞法检测细胞凋亡情况,观察不同浓度、不同作用时间下多被银莲花总皂甙是否对ACC-M细胞系有诱导凋亡作用。探讨中药对高肺转移腺样囊性癌细胞的作用,为防治腺样囊性癌远处转移提供一种有效的方法和途径。方法:1材料ACC-M细胞:北京大学口腔医院提供;多被银莲花总皂甙:购买于石家庄乐仁堂药店(产地为黑龙江省),于河北医科大学药学院经溶解与溶剂萃取提纯得到。2方法2.1实验药物的配制:多被银莲花总皂甙用含有二甲基亚砜(DMSO)的RPMI1640细胞培养液溶解配制成20mg/m L储存液,4℃保存,使用前用培养液稀释(DMSO<0.001%,对细胞无影响)。2.2 ACC-M细胞培养:在37℃、5%CO2恒温箱及饱和湿度条件下培养,10%胎牛血清和青霉素(100U/m L)、链霉素(100μg/m L)加入至RPMI1640培养基中,24h~48h传1代,用0.04%EDTA和0.25%胰蛋白酶(1:1)混合,其混合液用于消化传代。2.3 MTT比色试验:参考细胞生长曲线,应用对数生长期的细胞制成2.0×105/L细胞悬液,然后将其接种于96孔板,每孔100u L,培养24h,于实验组中加入多被银莲花总皂甙100u L,使药物浓度分别为1ug/m L、25ug/m L、50ug/m L、75ug/m L、100ug/m L,并设置对照组和调零孔,每组5个复孔。继续培养24h、48h、72h后,每孔中加入5g/L的预制MTT溶液20u L,继续培养4h后吸去各孔中全部上清液,然后在各孔中加入200u L二甲基亚砜溶液,于振荡器上振荡摇匀,使结晶充分溶解,将96孔板置于酶标仪上测各孔吸光度值并计算各组的生长抑制率,按作图法求出不同处理时间的IC50(生长抑制率为50%的药物浓度)。2.4倒置相差显微镜观察:将ACC-M细胞接种于50m L培养瓶中,应用倒置显微镜观察ACC-M细胞在不同药物浓度及不同培养时间下,实验组与对照组细胞生长状况。2.5吉姆萨染色法:将ACC-M细胞接种于6孔板中,各孔中放置盖玻片,细胞在盖玻片上爬片成功后分别在各孔中加入空白或含药培养基,细胞培养不同时间后,经吉姆萨染色,最后通过光学显微镜观察。2.6流式细胞术检测:采用处于对数生长期的ACC-M细胞,将细胞分别接种于50m L细胞培养瓶中,设计实验为两组即时间对照组和浓度对照组,通过Annexin-V-FITC和PI双标记活细胞,采用流式细胞仪检测经药物处理后不同时间、不同浓度下细胞凋亡情况。3统计分析实验结果采用SPSS10.0统计学软件进行统计,每次实验重复3次,实验数据以均值±标准差(x±SD)表示,分别对生长抑制率、吸光度值和凋亡率进行t检验和单因素方差分析。结果:1 MTT比色试验:实验表明多被银莲花总皂甙药物作用24h、48h、72h后的IC50分别约为46.3 ug/m L、56.59 ug/m L、44.60 ug/m L,其最高抑制率可达90.3%(Fig.1)。统计分析结果显示,各时间组不同浓度之间的吸光度值有显著性差异(P<0.05),各浓度组不同处理时间之间生长抑制率有显著性差异(P<0.05),多被银莲花总皂甙的药效与其浓度和作用时间具有明显正相关性。根据各时间组的IC50结果设计实验组药物作用浓度分别为25ug/m L、50ug/m L、75ug/m L。2倒置显微镜观察结果:对照组培养的细胞贴壁生长,呈“铺路石”样分布,细胞呈多角形,胞质饱满,细胞生长迅速,近中央处可见细胞核;实验组培养的细胞贴壁生长能力减弱,培养液中可见细胞悬浮脱落,贴壁细胞变圆,胞质皱缩,细胞变小,生长速度减慢,胞核颜色加深,细胞折光性增加。3吉姆萨染色结果:对照组细胞可见多个胞核,核质比增高;实验组细胞出现胞质浓缩、核质比降低现象,细胞核减少甚至消失,染色质沿核膜内侧排列。4流式细胞术检测结果:对照组细胞也出现凋亡,但凋亡率较低,最高达20.96%;实验组细胞凋亡明显,其凋亡率随着药物作用浓度与作用时间的增加而增高,最高达34.0%,经统计学分析,各浓度组与各时间组之间有显著性差异(P<0.05)。结论:多被银莲花总皂甙可以抑制人涎腺腺样囊性癌细胞株(ACC-M)的增殖,具有抑制增殖、诱导其凋亡的作用,且呈浓度和时间依赖性。