急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是临床上常见的急腹症之一,特别是重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis , SAP)并发症多,预后凶险,病死率可高达30%～40%。急性肺损伤及其终末阶段急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是AP最常见而严重的并发症,为临床SAP病人死亡的重要原因之一。神经激肽P物质是神经源性炎症反应中的重要介质,在免疫反应中亦起着重要作用。近年来,P物质在AP与其相关性肺损伤中的作用已被人们认识,并逐渐引起重视。已知P物质是一种舒血管物质,能增加血管通透性,导致血浆渗出与水肿。P物质能够诱导白细胞黏附与浸润,还能调节多种细胞因子的产生并与T细胞增殖,B淋巴细胞产生抗体及单核巨噬细胞与肥大细胞释放炎性介质,多形核白细胞呼吸爆发等功能作用相关。P物质主要是通过与相应神经激肽受体(neurokinin-1 receptors, NK-1R)结合,介导G蛋白偶联的第二信号途径而发挥作用的。研究发现,在AP过程中,P物质释放明显增加,其相应NK-1R表达亦明显增加。反映肺组织血浆、炎细胞渗出程度的肺湿/干重率明显增加,作为反映中性粒细胞聚集程度指标的髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活力亦明显增强。Lau等发现在雨蛙肽诱导的小鼠急性胰腺炎模型中通过腹腔给予P物质受体拮抗剂CP-96,345可以降低血清淀粉酶水平,减轻胰腺与肺组织的水肿、出血、炎细胞浸润等病理损伤,降低MPO活性,降低微血管通透性,从而为AP相关性肺损伤的治疗提供一新的途径。目的:本研究通过建立大鼠AP模型,并施予P物质受体拮抗剂L-703,606干预,观察肺组织的湿/干重比率,MPO活性,病理改变及P物质与NK-1R的表达情况,探讨其在AP炎症反应中的作用,探讨L-703,606对实验性AP的治疗作用及机制。方法:1动物模型的制备:选取雄性大鼠,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,取上腹正中作切口进入腹腔,用4号加工钝头头皮静脉针头于十二指肠乳头附近逆行插入胰胆管,以0.2 ml/min速度注入5%牛磺胆酸钠(0.1 ml/100g),推药后捏闭胰胆管入十二指肠处,观察3 min,剪除除结扎线,关腹。2实验分组:将雄性Sprague-Dawley大鼠54只,随机分为假手术组(SO组, n=18)、急性胰腺炎组(AP组, n=18)、急性胰腺炎治疗组(AP+ L-703,606组, n=18),后又以不同时间点3 h、6 h、12 h分为三个亚组,每个亚组为6只大鼠。AP+ L-703,606组于不同时间点造模前15 min经尾静脉预防性注射L-703,606(250 nmol /kg)。3肺组织湿/干重率测定:取左肺叶,以吸水纸吸干表面液体,称取湿重,置于60°C烤箱烤72 h至恒重,称取干重,计算湿/干重比率。4生化指标测定:取血清样本,采用全自动血清生化分析仪检测血清淀粉酶、脂肪酶,由河北医科大学第二医院生化室协助测定。5胰腺、肺组织学检查:采用石蜡切片,HE染色。6 MPO活力测定:取肺组织制成组织匀浆,用化学比色法测定,具体操作按南京建成生物工程研究所提供的测试盒说明书进行。7免疫组织化学染色:脱蜡至水,抗原热修复后,用3%过氧化氢孵育15 min。封闭一抗4°C过夜,阴性对照用PBS代替一抗。先后滴加二抗、三抗各15 min,后用3,3-二氨基苯联胺(DAB)显色,复染后封片。以细胞浆内呈现黄褐色颗粒为阳性表达。8 western blot: 100 mg肺组织经超声细胞粉碎机彻底粉碎,加入1 ml细胞裂解液,充分裂解,提取NK-1R膜蛋白(具体操作按说明书),取20μg与上样缓冲液充分混合,置于SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移至NC膜,以5%的脱脂奶粉封闭,一抗(1:250) 4°C孵育过夜,以相应的二抗室温下孵育2 h,抗体检测按Santa Cruz公司试剂盒说明书进行。结果:1大鼠胰腺的病理学变化:肉眼和光镜所见SO组胰腺及周围组织结构始终大致正常;AP组和AP+L-703,606组随着时间的推移,胰腺及周围组织水肿、出血和坏死面积逐渐扩大,程度逐渐加重,腹水也增多。2大鼠肺组织的病理学变化:肉眼和光镜所见SO组肺组织结构始终大致正常;AP组随着时间的推移,肺组织水肿、充血、出血,肺萎陷与不张和炎细胞聚集面积逐渐扩大,程度逐渐加重;而AP+ L-703,606组较AP组的组织结构损伤相对较轻。3血清淀粉酶的变化:在各时间点,SO组无明显变化,AP组及AP+ L-703,606组与SO组比较均明显升高(P<0.05)。4血清脂肪酶的变化:在各时间点,SO组无明显变化,AP组及AP+ L-703,606组与SO组比较均明显升高(P<0.05)。AP+ L-703,606组与AP组比较,12h时间点的脂肪酶升高(P<0.05)。5肺组织湿/干重比率:在各时点,SO组肺组织湿/干重比率在不同时间点无明显变化,与SO组比较,AP组与AP+ L-703,606组在各时点均明显升高(P<0.05),与AP组比较,AP+ L-703,606组在各时间点肺组织湿/干重比率明显降低(P<0.05)。6 MPO活力的变化:SO组MPO活力在各时间点无明显差异,与SO组比较,AP组与AP+ L-703,606组MPO活力在各时点明显增强(P<0.05)。与AP组比较,AP+ L-706, 303,在各时间点MPO活力明显降低(P<0.05)。7 P物质在肺组织中的表达:SO组肺组织有弱的P物质表达,AP组与AP+ L-703,606组,在血管内皮细胞,肺泡上皮细胞,炎性细胞及肺间质均有明显增强的P物质表达,免疫组化评分显示AP+L-703,606组表达强度低于AP组(P<0.05)。8 NK-1R在肺组织中的表达:密度扫描分析示SO组肺组织有弱的NK-1R表达,AP组与AP+ L-703,606组NK-1R表达明显增强(P<0.05),AP+ L-703,606组与AP组比较NK-1R表达无明显改变。结论:1逆行胆胰管内注射5%牛磺胆酸钠,通过检测血清淀粉酶、脂肪酶升高,胰腺组织HE染色观察到胰腺及周围组织水肿、出血和坏死,肺组织水肿、充血、出血、萎陷、不张与炎细胞浸润等表现,证实大鼠AP相关性肺损伤模型制备成功。2在AP大鼠肺组织中,P物质与其受体NK-1R的表达均明显高于对照组,表明P物质介导的信号转导途径在AP相关性肺损伤的发病机制中可能起作用。3 L-703,606是强有力的NK-1R拮抗剂,能降低P物质表达,降低肺组织湿/干重比率与MPO活力,改善肺组织病理损伤,认为L-703,606对大鼠AP相关肺损伤起到有效的治疗作用。