第一部分PAFAH1B2在人胰腺导管腺癌中的表达及临床意义目的:观察胰腺导管腺癌组织及对应的癌旁正常组织中PAFAH1B2蛋白和mRNA表达水平的差异,探讨PAFAH1B2表达与胰腺导管腺癌患者临床、病理参数及预后的相关性。方法:应用实时荧光定量PCR和免疫组化法检测人胰腺导管腺癌组织和对应癌旁组织PAFAH1B2的表达情况,分析PAFAH1B2的表达与胰腺导管腺癌患者的临床病理参数及预后的关系。结果:免疫组织化学结果显示,与对应的癌旁正常组织相比,胰腺导管腺癌组织中PAFAH1B2的蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.001);从TCGA数据库选取179例胰腺导管腺癌和GTEx数据库选取171例正常胰腺组织,分析PAFAH1B2在胰腺导管腺癌组织中的mRNA的表达情况。结果显示,对比GTEx数据库获取的正常组织数据,PAFAH1B2在胰腺导管腺癌组织中的mRNA表达水平显著升高。采用实时荧光定量PCR的方法检测胰腺导管腺癌及对应的癌旁正常组织中PAFAH1B2的mRNA表达情况,结果显示,与癌旁正常组织相比,PAFAH1B2在人胰腺导管腺癌组织中的mRNA表达水平也显著升高,差异有统计学意义(P<0.001);Western blot结果显示,与对应的癌旁正常组织相比,PAFAH1B2在胰腺导管腺癌组织中的蛋白表达水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.001);PAFAH1B2高表达组与低表达组之间的区域淋巴结转移及TNM分期具有显著性差异(P<0.05);PAFAH1B2蛋白低表达组的胰腺导管腺癌患者的总生存率和疾病无进展生存率都要明显高于PAFAH1B2蛋白高表达组的胰腺导管腺癌患者(P<0.0001);PAFAH1B2 mRNA高表达的胰腺导管腺癌患者的预后更差(P<0.0001)。小结:对比癌旁组织,胰腺导管腺癌组织中PAFAH1B2的mRNA和蛋白表达水平显著增高,PAFAH1B2的表达与患者区域淋巴结转移及TNM分期具有相关性。PAFAH1B2蛋白及mRNA高表达的胰腺导管腺癌患者的总生存率和疾病无进展生存率都要明显低于PAFAH1B2蛋白及mRNA低表达的胰腺导管腺癌患者。第二部分PAFAH1B2对胰腺导管腺癌细胞迁移、侵袭和转移的影响目的:探讨PAFAH1B2在胰腺导管腺癌细胞上皮间质转化以及迁移、侵袭和转移中的作用。并建立裸鼠原位成瘤肝转移模型,在动物实验中证实PAFAH1B2促胰腺导管腺癌细胞肝转移的作用。方法:通过基因富集分析,明确PAFAH1B2高表达的肿瘤样本与肿瘤细胞上皮间质转化的关系。并应用siRNA-PAFAH1B2及PAFAH1B2质粒转染人胰腺导管腺癌细胞株CFPAC-1和L3.7-2,构建PAFAH1B2沉默的胰腺导管腺癌细胞株CFPAC-1和PAFAH1B2过表达的胰腺导管腺癌细胞株L3.7-2。Western blot技术检测沉默和过表达PAFAH1B2后,E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Snail和Slug的表达情况,采用免疫荧光法检测E-Cadherin和N-Cadherin的表达情况。采用Transwell迁移实验的方法检测PAFAH1B2对胰腺导管腺癌细胞侵袭、迁移的影响。使用10只裸鼠进行胰腺组织注射胰腺导管腺癌细胞建立胰腺癌肝转移动物模型,实验分为2组,PAFAH1B2过表达组和对照组vector,每组各5只。6周后处死裸鼠,观察裸鼠胰腺癌肝转移情况,计算各组裸鼠肝转移瘤的数量。结果:通过GSEA分析软件对TCGA数据库下载的20例胰腺导管腺癌低表达及高表达样本的基因表达原始数据进行分析发现PAFAH1B2高表达的肿瘤样本富集了与肿瘤细胞间质转分化有关的基因集,因此我们推测PAFAH1B2可能与肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移密切相关。Western blot检测结果显示与转染空白对照siRNA的CFPAC-1细胞株相比,沉默PAFAH1B2的表达显著上调了上皮细胞的特征性标记E-Cadherin的表达,而抑制了间质细胞的特征性标记N-Cadherin、Vimentin、Snail和Slug的表达。与转染空载质粒的L3.7-2细胞相比,过表达PAFAH1B2抑制了L3.7-2细胞E-Cadherin的表达,上调了N-Cadherin、Vimentin、Snail和Slug的表达(P<0.05)。免疫荧光化学染色检测E-Cadherin和N-Cadherin的表达结果与Western blot的结果相一致。细胞侵袭分析显示,与转染空白对照siRNA的CFPAC-1细胞株相比,沉默PAFAH1B2的表达明显抑制了CFPAC-1细胞的迁移和侵袭(P<0.05)。而过表达PAFAH1B2则显著促进了L3.7-2细胞迁移和侵袭(P<0.05)。接种6周后处死裸鼠,结果发现胰腺原位成瘤的体积两组间无显著差异;通过检测肝转移灶的数目发现,过表达PAFAH1B2组裸鼠,肝脏转移瘤数目增多,提示胰腺导管腺癌细胞株的转移能力增强;我们进一步通过转移瘤HE染色验证了胰腺导管腺癌细胞株在肝脏的转移情况。小结:沉默PAFAH1B2基因表达的胰腺导管腺癌细胞侵袭、转移能力减弱,抑制EMT的发生;PAFAH1B2基因过表达的胰腺导管腺癌细胞侵袭、转移能力增强,促进EMT的发生。过表达PAFAH1B2胰腺癌裸鼠模型促进了肝转移的发生。因此,临床上胰腺导管腺癌具有恶性程度高,易转移等生物学特点,可能与PAFAH1B2基因表达增强有关。第三部分PAFAH1B2在胰腺导管腺癌细胞中高表达的分子机制目的:分析HIF1α与PAFAH1B2表达的相关性,沉默及过表达HIF1α对胰腺导管腺癌细胞株PAFAH1B2的蛋白和mRNA的表达的影响,探讨缺氧情况下PAFAH1B2在胰腺导管腺癌细胞中高表达的分子机制。方法:应用免疫组织化学法检测HIF1α与PAFAH1B2表达的相关性。从TCGA数据库选取胰腺导管腺癌患者的数据,分析HIF1α和PAFAH1B2在胰腺导管腺癌组织中mRNA表达的相关性。将CFPAC-1细胞和L3.7-2细胞在体外分别采用正常氧及缺氧培养条件,观察缺氧对PAFAH1B2表达产生的影响。构建HIF1α的过表达质粒(HIF1A)和小干扰RNA(si HIF1A)分别转染CFPAC-1细胞和L3.7-2细胞,观察PAFAH1B2的蛋白和mRNA的表达情况。采用染色质免疫共沉淀实验和荧光素酶检测HIF1α是否能结合于PAFAH1B2的启动子区域并增强其转录活性。结果:免疫组织化学结果显示:HIF1α和PAFAH1B2在胰腺导管腺癌组织中的蛋白表达均显著升高,且两者共定位于肿瘤细胞的胞浆,具有正相关(R=0.51)。Spearman相关性分析显示,PAFAH1B2在胰腺导管腺癌组织中mRNA的表达与HIF1α呈正相关(R=0.45),PAFAH1B2 mRNA的表达在HIF1αmRNA高表达组显著高于HIF1αmRNA低表达组。Western blot结果显示在缺氧条件下,PAFAH1B2蛋白表达显著增加,同时HIF1α的表达也明显升高。实时荧光定量PCR的结果与Western blot结果相一致(P<0.05)。我们构建了HIF1α的过表达质粒(HIF1A)和小干扰RNA(si HIF1A)分别转染CFPAC-1细胞和L3.7-2细胞,Western blot结果显示HIF1A质粒转染后明显上调了两种肿瘤细胞中HIF1α的蛋白表达;与此同时PAFAH1B2的蛋白表达也呈现显著上调。siHIF1A转染后显著抑制两种肿瘤细胞中HIF1α的蛋白表达,也同时抑制了PAFAH1B2的蛋白表达。实时荧光定量PCR的结果与Western blot结果相一致(P<0.05)。染色质免疫共沉淀结果显示HIF1α能够结合于PAFAH1B2的启动子区域,同时缺氧也促进了HIF1α与PAFAH1B2启动子区域的结合。荧光素酶报告基因分析显示HIF1α过表达显著增加了PAFAH1B2基因的启动子活性。当我们将PAFAH1B2基因的启动子上的HRE区域碱基序列从GCCTG突变为GCATG后,HIF1α过表达不再能够增加PAFAH1B2基因的启动子活性。小结:HIF1α通过与PAFAH1B2的基因启动子上的HRE序列的结合而增加PAFAH1B2的基因启动子活性,从而促进PAFAH1B2的表达增加。PAFAH1B2是HIF1α的靶基因,促进了胰腺导管腺癌的转移。结论:1.胰腺导管腺癌组织中PAFAH1B2的mRNA和蛋白表达增多,PAFAH1B2高表达与区域淋巴结转移及TNM分期呈正相关。PAFAH1B2蛋白及mRNA高表达的胰腺导管腺癌患者的总生存率和疾病无进展生存率都要明显低于PAFAH1B2蛋白及mRNA低表达的胰腺导管腺癌患者。2.沉默PAFAH1B2基因的表达,胰腺导管腺癌细胞侵袭、转移能力减弱,抑制EMT的发生;过表达PAFAH1B2基因的胰腺导管腺癌细胞侵袭、转移能力增强,促进EMT的发生。PAFAH1B2基因过表达细胞株的裸鼠胰腺导管腺癌肝转移瘤模型,肝脏转移瘤数量明显增多,动物实验亦验证了以上结论。3.HIF1α通过与PAFAH1B2的基因启动子上的HRE序列的结合而增加PAFAH1B2的基因启动子活性,从而促进PAFAH1B2的表达增加。PAFAH1B2是HIF1α的靶基因,促进了胰腺导管腺癌的转移。