氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)是一种在生物工业及手性合成领域中广泛应用的生物催化剂，其细胞质外膜空间含有众多脱氢酶，可将羟基化合物不完全氧化生成相应的醛、酮或酸，在维生素C、二羟基丙酮、米格列醇等工业生产有着重要的应用。本研究室率先报道了氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞氧化1，2-丙二醇生成D-乳酸的模式反应，并通过诱变育种获得一株高效菌株M5(G.oxydans M5)，但对催化该反应的相关酶的研究却鲜有报道。本课题试图寻找M5菌株氧化1,2-丙二醇生成D-乳酸的功能基因，并扩展相关酶在醇氧化反应中的功能研究，为改进氧化葡萄糖酸杆菌已有的和开拓新的生物转化工艺打下坚实的理论基础。主要工作如下：　　 (1)氧化葡萄糖酸杆菌M5膜结合乙醇脱氢酶(ADH)的纯化与鉴定。　　 通过超速离心收集膜组分、表面活性剂溶解膜蛋白、CM-cellulose柱层析纯化等步骤，获得了电泳纯的具有1，2-丙二醇脱氢酶活性的脱氢酶，此酶由两个亚基组成，其表观分子量分别为80 kDa和50 kDa。经MALDI-TOF MS质谱分析与肽质量指纹图谱检索鉴定，80 kDa大亚基与氧化葡萄糖酸杆菌模式菌621H的膜结合乙醇脱氢酶大亚基(GOX1068)的氨基酸序列匹配度极高。基因扩增结果也显示菌株M5的ADH与模式菌621H的ADH同源率为100％，表明纯化得到的酶是由乙醇脱氢酶基因所编码。酶学性质分析表明，该酶的最适反应温度是30℃，最适pH值5.5～6.0；该酶能催化多种一元醇、二元醇，但对包含3个以上羟基的多元醇基本无氧化活性；其催化活性随着底物C链长度的增加而减小；大多数金属离子及抑制剂(Cu2+、Fe3+、Ca2+、EDTA等)对此酶都有抑制作用。　　 (2)膜结合乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶在氧化葡萄糖酸杆菌M5对1，2-丙二醇氧化生成D-乳酸反应中的功能研究。　　 为了进一步确证细胞中膜结合乙醇脱氢酶与1，2-丙二醇氧化的关系，对编码该酶的基因进行了敲除与突变株回补实验。当乙醇脱氢酶基因缺失时，突变菌株G.oxydans M5adhA：：Km几乎完全丧失了催化1，2-丙二醇生成D-乳酸的能力；而当带有乙醇脱氢酶全基因的重组质粒pBBR1MCS5-adhAB对G. oxydans M5 adhA：：Km进行功能回补时，1，2-丙二醇氧化生成D-乳酸的活性得到了部分恢复。上述结果表明，G. oxydans M5膜结合乙醇脱氢酶是催化1，2-丙二醇生成D-乳酸的关键酶。　　 实验中发现除了膜结合乙醇脱氢酶以外，G. oxydans M5中的膜结合乙醛脱氢酶(ALDH)也参与了细胞氧化1，2-丙二醇的反应，但不是关键酶。实验结果显示，当ALDH基因缺失时，突变株G. oxydans M5 aldhA：：Km所催化的D-乳酸生成量与原始菌相比降低了约25％。　　 (3)膜结合乙醇脱氢酶基因缺失菌株和膜结合乙醛脱氢酶基因缺失菌株在醇氧化反应中的功能研究。　　 首先，在水相体系中，以一系列醇为底物，分别研究了M5菌株、M5 adhA：：Km突变株和M5 aldhA：：Km突变株的催化功能，从而探讨了ADH与ALDH在醇氧化生成酸反应中的功能。结果显示，膜结合乙醇脱氢酶及乙醛脱氢酶在氧化葡萄糖酸杆菌催化伯醇及伯二醇的氧化，进而生成相应的酸的过程中起着非常关键的作用。对甲醇转化生成甲酸、乙二醇转化生成羟基乙酸、苯乙二醇转化生成扁桃酸、羟基丁酸(或者羟基戊酸、羟基己酸)转化生成丁二酸(或者戊二酸、己二酸)、2甲基1，3-丙二醇转化生成2甲基-3-羟基丙酸等的反应中，膜结合乙醇脱氢酶是必需的；而对于由乙醇转化生成乙酸、正丙醇转化生成正丙酸、正丁醇转化生成正丁酸等反应，膜结合乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶只起着参与的作用；此外，这两个酶均不参与仲醇(如2，3-丁二醇)及多羟基醇(如甘油)的转化。　　 其次，设计两相反应体系，以苯乙醇为底物，分析了ADH和ALDH在醇氧化生成醛反应中的作用。当ADH基因缺失时，氧化葡萄糖酸杆菌几乎完全丧失了氧化苯乙醇生成苯乙醛的能力；而当ALDH基因缺失时，苯乙醛的积累明显增加。从而证实了氧化葡萄糖酸杆菌氧化苯乙醇等醇生成酸的机制，即膜结合乙醇脱氢酶催化醇生成相应的醛，后者进一步被膜结合乙醛脱氢酶氧化生成酸。