随着以德国拜耳公司和日本特殊农药公司联合开发的吡虫啉(imidacloprid)为代表的新烟碱类杀虫剂的开发应用,作用于昆虫烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs)的神经毒剂成为了近年来研制开发的重点。此类杀虫剂选择性的作用于昆虫的烟碱型乙酰胆碱受体,对哺乳动物毒性则较低,这引起了国内外农药学家和昆虫毒理学家的重视。许多研究者通过对该类化合物官能团变换和构效关系研究,还相继开发了一系列高效的新烟碱类杀虫剂,如啶虫脒(acetamiprid),烯啶虫胺(nitenpyram)以及噻虫嗪(thiamethoxam)等。在所有商品化的新烟碱类杀虫剂中,作为昆虫nAChRs的选择性激动剂都含有-NO2或者-CN基团反式共轭结构,例如吡虫啉和噻虫胺。最近,保持硝基和氰基的顺式位置作为一种新的分子设计策略,如稠杂环化合物或者将代替基固定为顺式共轭结构,合成了一些潜在的具有新烟碱类作用的化合物,这些化合物表现出较宽范围的杀虫活性(Tian et al.,2007; Shao et aL.,2008,2009).本文就一个典型的顺式硝基共轭的化合物IPPA152201(命名为环氧虫啶)进行其作用机制及靶标的定位的研究。一、顺式硝基新烟碱类IPPA152201作用机制的研究本文选择一个典型的顺式硝基共轭的化合物IPPA152201来进行其毒性和药理学研究,以了解这些硝基共轭新烟碱类的作用机制。IPPA152201对褐飞虱的一个敏感品系表现出与吡虫啉相当的毒性,在吡虫啉抗性品系上没有明显的交互抗性。IPPA152201对离体的美洲大蠊神经元表现出较好的作用效力,由IPPA152201诱导的反应可以被nAChRs典型的拮抗剂甲基牛扁碱(Methyllycaconitine, MLA)和二氢-β-刺、桐啶(Dihydro-β-erythroidine, DHβE)阻断。电生理实验中检测到IPPA152201对爪蟾卵母细胞内表达的杂合受体(昆虫Nlal/。甫乳动物β2)的电信号,同时,这种作用又可被拮抗剂MLA和DHβE抑制。这些数据表明IPPA152201作为激动剂作用于昆虫的nAChRs.此外,将本实验室前期研究中发现的导致吡虫啉抗性的Y151S突变引入杂合受体中,评价该突变对IPPA152201活性的影响。与野生类型的Nlα1/β2相比,这个突变使IPPA152201的Imax降低了63.2%,EC50增高了1.5倍,比其对吡虫啉造成的影响小的多(该突变使吡虫啉的Imax降低了16.0%,EC5o增高了2.8倍)。高杀虫活性和Y151S突变较小影响使IPPA152201成为控制褐飞虱的潜在的优势杀虫剂。二、美洲大蠊烟碱型乙酰胆碱受体α6、α7亚基基因的克隆采用简并引物PCR和RACE技术首次克隆了美洲大蠊2个烟碱型乙酰胆碱受体的全长基因。通过与其他昆虫nAChRs亚基序列比对和分析,发现这些基因与昆虫的nAChRs亚基具有很高的同源性,它们均具有烟碱型乙酰胆碱受体亚基的典型特征,如保守的半胱氨酸(α亚基所具有典型的双半胱氨酸结构)、与配基结合密切相关的保守氨基酸残基形成的环loopA-C(α亚基)、4个跨膜片段以及糖基化位点等。因此,根据推导的氨基酸序列相似性比较和系统进化树构建,分别将这2个基因命名为美洲大蠊Paα6和Paa7亚基。三、环氧虫啶在烟碱型乙酰胆碱受体上的靶标亚基定位外源重组杂合受体Nlα1/β2电生理研究表明,环氧虫啶作用于昆虫nAChRs的a1亚基,与吡虫啉等新烟碱类杀虫剂相同。但该化合物是否作用于α6亚基(潜在的同型五聚体亚基),这方面还没有开展过研究。昆虫nAChRs的a6亚基是多杀菌素的作用靶标亚基,但不是吡虫啉等新烟碱类杀虫剂的靶标亚基。本文采用集合RNA干扰和生物测定的方法来初步判断新化合物作用靶标。在干扰美洲大蠊α6亚基表达之后,进行化合物的生物测定,将干扰后生测结果与正常试虫生测结果对比,根据该亚基的存在是否对化合物的毒力产生影响以判断其与化合物的靶标关系。对于美洲大蠊的活体干扰,本文采用了注射和灌喂两种方式,并采用RT-PCR技术对Paα6干扰后的表达量进行分析,发现两种方法都在干扰后的第四天达到最好的干扰效果,最大干扰效率在70%左右,其中注射干扰的最大干扰效率比灌喂干扰的稍高。同时,对生物测定方法进行了改进,采用了灌喂法,与点滴法相比,不仅具有药物定量供给的优点,还适用于水溶性较高的杀虫剂的生测实验。RNAi干扰后,测定了环氧虫啶、吡虫啉、多杀菌素等化合物对美洲大蠊的毒力效果,并将其与正常试虫的生测结果对比。结果显示,对于多杀菌素,干扰组的死亡率只有正常组的三分之一左右,验证了nAChRs的α6亚基确实是多杀菌素的作用靶标,该结论已被报道。对于环氧虫啶,干扰组的死亡率也显著低于正常组,我们初步判断环氧虫啶对α6亚基也有一定的作用,可以结合进一步实验进行证实。而对于吡虫啉来说,α6亚基表达量的降低对其作用效果影响不大,与已有的报道相符。四、环氧虫啶对美洲大蠊毒力作用及药效现象的观察在环氧虫啶对美洲大蠊的生测实验中发现,不同浓度的环氧虫啶灌喂或是点滴处理美洲大蠊,均会导致其腹部膨大的表型,解剖后观察为其前肠的剧烈膨大导致腹部的膨大。前肠剧烈膨大后,昆虫无法正常取食和消化,中毒严重的试虫在约三天后会逐渐死亡。该表型现象为首次报道,从药物反应的现象推测,环氧虫啶不仅作用于昆虫的神经系统,在昆虫消化道中可能还存在其他(次级)的作用靶标。