第一部分162例血管性血友病的临床分析研究目的血管性血友病(von Willebrand disease．VWD)是由于血管性血友病因子(von Willebrand factor,VWF)基因突变引起血浆中VWF数量减少或质量异常所导致的最常见的遗传性出血性疾病，呈常染色体遗传。患者自幼可有轻度或中度皮肤黏膜出血、鼻衄、胃肠道出血及外伤后出血不止等症状，女性常有月经过多。遗传性VWD分为三种类型：1型(VWF量的部分缺乏)、2型(VWF质的缺陷，又分为2A、2B、2M和2N四个亚型)和3型(VWF量的完全缺乏)，这三种类型和各亚型间具有不同的生理病理机制，治疗方法上也有各自特点。因此需要实验室进行系列检测以确保准确诊断和分型。本部分的回顾性研究代表了单中心血管性血友病（VWD）患者的流行病学特点、临床特征、诊治现状。方法回顾性分析162例VWD患者的临床资料、分型诊断结果及治疗、转归情况。结果162例患者中男性76例、女性86例，男性平均年龄7.2（2.0~41.0）岁，女性平均年龄20.7（5.0~48.0）岁。1型VWD患者86例（53.1%），2型42例（25.9%，2A型33例、2M型4例、2N型5例），3型34例（21.0%）。87例患者（53.7%）有明确家族史。出血表现以皮肤瘀斑（61.7%）、鼻出血（53.7%）、手术或外伤后出血不止（53.1%）为主，月经量多为女性患者常见主诉（66.3%）。Vicenza出血评分标准结果显示56例患者（34.6%）有异常出血评分。45例患者（27.8%）予血制品替代治疗，8例患者使用了1-去氨基-8-右旋-精氨酸血管加压素治疗。57例月经量多的女性患者中，25例并发贫血者予补铁治疗。对于出血量多不易控制的患者，8例需联合孕激素控制出血，2例行子宫切除术。结论VWD是临床表现有较大异质性的常见的遗传性出血性疾病，对于疑诊VWD的患者应分步进行确诊及分型检查，从而有效地实施个体化治疗。第二部分6例血管性血友病的实验诊断和基因分析研究目的血管性血友病因子(von Willebrand Factor，VWF)是血管内皮细胞和骨髓巨核细胞合成的一种糖蛋白。VWF质的缺陷和量的缺乏会导致血管性血友病(vonWillebrand disease，VWD)。基因分析有助于了解分子发病机制，对携带者的判定、产前诊断以及患者的预后、治疗都有重要的意义。本研究从6例VWD患者的临床及基因诊断出发，探讨基因型与表现型的相关性，旨在从分子水平阐明VWD的发病机制。方法采用第一部分所述VWD系列实验，以全血细胞计数（主要为血小板计数）、部分激活的凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）和纤维蛋白原含量（Fg）作为VWD的筛查实验；VWF抗原（VWF∶Ag）测定、VWF瑞斯托霉素辅因子活性（VWF∶Rco）、血浆凝血因子VIII活性（FVIII∶C）作为确诊实验；以VWF多聚体分析、瑞斯托霉素诱导的血小板聚集试验（RIPA）、VWF胶原结合试验（VWF∶CB）、VWF和凝血因子VIII结合试验（VWF∶FVIIIB）作为分型实验，确诊6例遗传性VWD（分别为3例2A型，3例3型）。为了增加对2A型和3型VWD分子发病机制的认识，我们用常规PCR分别扩增这6例VWD患者的VWF基因，并进行测序分析。结果6例患者中3例为2A型，3例为3型。测序结果鉴定到7个基因突变，包括4814A>C(Y1605S)、752A>G(E248G)、4789C>T(R1597W)、421G>A(D141N)、3379+1G>A、2480G>A(C827Y)、3897delT，其中4814A>C(Y1605S)、752A>G(E248G)、2480G>A(C827Y)、3897delT为国际首次报道。Y1605S的杂合性突变恰位于A2区ADAMTS13蛋白酶裂解位点(Y1605-M1606)，使原来隐藏的位点得以暴露，VWF因子对ADAMTS13水解酶敏感性增加，导致2A型VWD的发生。E248G的杂合性突变位于D1区，属于不成熟VWF蛋白的前肽部分，影响VWF多聚化，导致胞内贮留，是2A型VWD的发生原因。R1597W为2A型VWD较常见的突变类型，已被证实可导致VWF上ADAMTS13蛋白酶裂解位点(Y1605-M1606)附近的空间构象发生改变，使突变蛋白对ADAMTS13敏感性增高。3379+1G>A的纯合突变影响正常RNA的剪切过程，产生含有提前终止密码子的异常剪接体，使得血浆中VWF水平显著减低。C827Y位于D’区，D’区Cys参与VWF链内二硫键形成，与分子内结构稳定有关，影响多聚体的形成和促进突变蛋白的清除，其合并3897delT的框移突变导致VWF合成显著减少，推测是3型VWD的发病机制。而3型VWD患者4中，仅发现D141N的杂合性突变，是否存在其他类型的突变及其发病机制仍需进一步鉴定和研究。结论VWD具有复杂的分子发病机制，这不仅要求有一套系统的实验方法以对VWD进行明确诊断和分型，还需要运用多种分子生物学技术对其进行深入的研究。本组试验所涉及的6例VWD患者经分型诊断试验确诊为3例2A型和3例3型，基因测序结果增加了对2A型和3型VWD发病机制的认识。然而遗憾的是，这6例VWD患者的突变类型没有直接得到功能实验证实。这需要采用定点突变技术构建携带特定突变位点的突变型VWF质粒，并在细胞中表达突变型质粒，以明确基因突变对VWF表达量及功能的影响。