小鼠精子的低温保存为保存繁育不良的疾病模型小鼠和采用基因工程手段所获得的大量小鼠品系提供了一种比较安全、经济的资源保存方法。但由于小鼠低温生物学的某些限制，小鼠精子的低温保存仍存在较大的困难，本研究进行多品系小鼠精子冷冻的实验，并以复苏后体外受精率作为冷冻成败的标准，探讨小鼠精于冷冻的影响因素，总结供精小鼠的选择原则，摸索冻融小鼠精子成功体外受精的方法，在此基础上运用成功冷冻的小鼠精于进行胚胎工程实践：将冻融精子体外受精获得的胚胎直接移植、胚胎冷冻复苏后再移植，均获得存活的新生个体；我们还将精子冷冻技术用于昆明小鼠标准化育种研究，避免了活动物运输带来的麻烦，节省了检验检疫费用，并加快了研究进程。 一、小鼠精于冷冻的影响因素研究 1、遗传背景对小鼠精子冷冻的影响 采用小鼠精于冷冻、冻融精子体外受精的方法，初步探究小鼠精于冷冻的影响因素，摸索合适的受精浓度，观察冷冻保护剂对IVF的影响，本实验选用同一年龄(15周龄)五种不同品系小鼠分别进行精子冷冻、复苏，比较各品系冷冻效果(冻融后精子活力)及冻融精子的体外受精(IVF)率，并用新鲜精子IVF作为对照，以体外受精结果作为判断精于冷冻效果的最终标准。 2、年龄对小鼠精于冷冻的影响 对不同周龄昆明(KM)小鼠进行精于冷冻，研究小鼠精子冷冻的影响因素，并将同一年龄小鼠分为冷冻前近期交配过和长期未交配两组，以研究雄鼠的生理周期和状态对精子冷冻的影响，探讨精子冷冻前供体的选择标准。为精子冷冻在小鼠胚胎工程中的应用打下基础。 综合本研究结果：冷冻后各品系小鼠精子复苏后活力约在15％～50％之间；冻融小鼠精于体外受精结果随遗传背景的不同差异显著，受精率分别为：KM小鼠68.4％、ICR小鼠30.3％、DBA／2J小鼠47.2％、C57BL／6J小鼠6.8％、BALB／cA小鼠25％。冻融精子IVF得到的胚胎可以耐受体外培养。10周龄KM小鼠精子不能成功冷冻或者冷冻效果较差复苏率(0～20％)，15、20周龄KM小鼠均可成功冷冻复苏率(30％～40％)，用于冷冻的小鼠周龄影响冷冻效果及受精率。 二、小鼠冻融精子与新鲜精子体外受精的比较 冻融过程造成部分小鼠精子结构破坏和功能障碍，能够使卵受精的精子也发生实验小鼠精子低温保存及体外受精的研究中文摘要了某些变化，使冻融精子体外受精(IVF)与新鲜精子有所不同。本实验用冷冻复苏后的精子分别与颗粒细胞卵母细胞复合体，及用透明质酸酶去除颗粒细胞的裸卵IVF观察受精率的异同;精子复苏并预培养lh，体外分别受精3h、4h、sh、6h后洗卵比较受精率;精子复苏后分别预培养0.5h、lh、1.5h、Zh后与卵细胞作用6h洗卵，观察受精率，所有实验均用新鲜精子进行对照。 通过研究，发现去除颗粒细胞后体外受精率下降，且精子活力愈低下降程度越大;冷冻复苏过程使部分精子获能，不需长时间预培养即可使卵细胞受精，相反新鲜精子预培养时间低至半小时受精率大大降低，预培养1一1.5h使精子获能对新鲜精子的体外受精是必需的;精卵接触后冻融精子使卵受精速度较新鲜精子快。本实验探讨了冻融精子IVF条件对受精率的影响，通过体外受精的变化分析冻融后精子发生的变化，从而总结了提高冻融精子受精率，和利用效率的实验方法。三、利用小鼠冻融精子进行胚胎工程实践 将昆明(KM)小鼠精子进行冷冻，复苏后体外受精(I VF)，IVF获得的2细胞胚胎分别进行胚胎移植、体外培养、胚胎冷冻及复苏后移植，并用新鲜精子IVF作为对照。结果显示，精子冷冻并不影响IVF获得胚胎的移植产仔率(5 1 .8%一54忍%)，体外培养效果(发育至囊胚比例为57.4%)、胚胎冷冻复苏率(82.8%)及冷冻胚胎复苏后的移植产仔率(53.3%)，与新鲜精子体外受精得到的胚胎差异不显著。四、应用精子冷冻技术进行昆明小鼠育种的研究 昆明(KM)小鼠标准化研究中，采集武汉生物制品研究所、上海第一生化制药厂普通级KM小鼠的精子冷冻并运输，冻融精子与中科院上海实验动物中心KM雌鼠超排的卵进行体外受精，得到杂交1代2细胞胚胎，用中科院动物中心KM鼠冻融精子对照。无菌条件将2细胞胚胎移植入SPF级假孕鼠，受体饲养于独立通气笼具(IVC)中。 本实验胚胎移植后，平均产仔率为51.9%，离乳率为100%。三种群12周龄KM雄鼠精子冷冻复苏率，IVF率，移植产仔率均无显著差异(P>0.05)。仔鼠经微生物、寄生虫检测达sPF标准。结果表明，利用冷冻精子，通过IvF、胚胎移植能够方便快速的建立种群间杂交1代，并实现生物净化。