miRNA-137在癫痫中的表达和功能研究

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第一部分:miRNA-137在颞叶癫痫患者及模型动物脑组织中的表达研究目的:研究miRNA-137在颞叶癫痫患者术后脑组织中的表达以及在小鼠匹罗卡品癫痫模型和戊四氮慢性点燃癫痫模型脑组织中的表达特点。方法:1.从课题组已经建立的难治性颞叶癫痫患者术后脑组织库中随机抽取18例颞叶脑组织标本作为癫痫组,抽取12例年龄性别匹配的颅脑外伤患者术后颞叶脑组织标本作为对照组。2.选择成年雄性C57BL/6小鼠,由腹腔给予匹罗卡品或者戊四氮构建癫痫慢性期动物模型,选择自发性发作(或完全点燃)的小鼠作为癫痫组,未自发性发作(或未点燃)的小鼠为对照组。3.用荧光定量PCR技术检测miRNA-137在颞叶癫痫患者及癫痫模型小鼠脑组织标本中的表达变化。结果:1.miRNA-137在颞叶癫痫患者脑组织中的表达水平较对照组明显降低(P<0.05);2.在匹罗卡品癫痫慢性期小鼠模型中,miRNA-137在有自发性发作的小鼠的海马和皮质中的表达水平均较无自发性发作的小鼠降低(p<0.05);3.在戊四氮慢性点燃癫痫小鼠模型中,mirna-137在完全点燃小鼠的海马和皮质中的表达水平均较未点燃的小鼠降低(p<0.05)。结论:mirna-137在颞叶癫痫患者和癫痫模型小鼠脑组织中的表达水平均降低,提示mirna-137可能与癫痫的发生发展过程具有密切关系。第二部分mirna-137体内干预对癫痫动物模型行为学的影响目的:利用mirna-137特异性激动剂agomir和抑制剂antagomir对小鼠进行海马区微量注射干预,研究mirna-137在脑内表达水平的变化对癫痫模型小鼠行为学的影响。方法:1.选择成年雄性c57bl/6小鼠,随机分为五组,分别为对照组(control组),agomirnc组,agomir组,antagomirnc组和antagomir组。各组分别给予生理盐水,agomirscramblednc0.2nmol,agomir0.2nmol,antagomirscramblednc0.8nmol以及antagomir0.8nmol海马区双侧立体定位微量注射。2.采用荧光定量pcr技术和激光共聚焦技术检测agomir及antagomir海马立体定位注射后的干预效率。3.腹腔注射匹罗卡品(320mg/kg)建立匹罗卡品癫痫模型,观察各组小鼠首次自发性发作的潜伏期和发作的次数;每日给予腹腔注射阈下剂量(35mg/kg)的戊四氮建立戊四氮慢性点燃癫痫模型,观察各组小鼠完全点燃所需的时间和痫性发作的级别。结果:1.mirna-137agomir海马立体定位注射干预后,mirna-137的表达水平升高。与control组相比,其在干预后3天,1周,2周及4周组的表达均升高(p<0.05);antagomir海马注射干预后,海马区mirna-137的表达水平降低。与control组相比,其在干预后3天,1周,2周及4周组的表达均显著降低(p<0.05)。激光共聚焦结果显示,agomir及antagomir干预后,海马区可见带有绿色荧光的干预剂表达;2.在匹罗卡品癫痫模型中,agomir组的首次自发性发作的潜伏期较control组和agomirnc组延长,自发性发作的次数较control组和agomirnc组降低;与control组和antagomirnc组相比,首次自发性发作的潜伏期在antagomir组明显缩短,自发性发作的次数较control组和antagomirnc组增加(p<0.05);3.在戊四氮慢性点燃模型中,与control组和agomirnc组相比,agomir组完全点燃所需要的时间明显延长(p<0.05)。agomir组痫性发作级别在第5-12天时较control组降低,其差异具有统计学意义(p<0.05);antagomir组完全点燃所需的时间较control组和antagomirnc组缩短,而其痫性发作级别在第4-9天时较control组升高,这些差异同样具有统计学意义(p<0.05)。结论:1、mirna-137agomir干预可特异性增加海马mirna-137的表达水平;mirna-137antagomir干预能够特异性抑制海马mirna-137的表达。2、mirna-137体内干预可以引起癫痫模型小鼠发作潜伏期和严重程度的改变。第三部分mirna-137对小鼠海马神经元兴奋性的影响目的:利用mirna-137特异性激动剂agomir和抑制剂antagomir对小鼠进行海马区立体定位微量注射干预,探讨mirna-137在脑内表达水平的变化对小鼠海马脑片椎体神经元兴奋性的影响。方法:1.选择健康雄性c57bl/6小鼠,随机分为五组:对照组(control组),agomirnc组,agomir组,antagomirnc组和antagomir组,并通过海马区立体定位微量注射的方式给与相应的干预。2.用全细胞膜片钳技术记录各组小鼠海马脑片ca3区椎体神经元在无镁脑脊液灌流下所诱发的动作电位(ap),微小兴奋性突触后电流(mepscs),微小抑制性突触后电流(mipscs)以及配对脉冲比率(ppr)的变化情况。结果:1.agomir组海马区椎体神经元ap的放电频率较control组和agomirnc组均降低,而antagomir组的ap放电频率较control组和antagomirnc组均升高(p<0.05);2.与control组和agomir NC组相比,海马椎体神经元m IPSCs的放电频率在agomir组升高,而antagomir组mIPSCs放电的频率较control组和antagomir NC组均降低(P<0.05),它们的差异具有统计学意义。另一方面,mIPSCs放电的幅值在各组之间并无明显统计学差异(P>0.05);3.agomir组和antagomir组海马椎体神经元EPSCs的放电频率和幅值均较对照组无明显差异(P>0.05);4.agomir组海马区椎体神经元的PPR值较control组明显降低(P<0.05)。结论:1、miRNA-137体内干预可对小鼠海马脑片椎体神经元的兴奋性产生负性调控效应。2、miRNA-137体内干预可通过影响突触前抑制性神经递质的释放,来调控小鼠海马脑片椎体神经元抑制性突触后电流放电频率。
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