生物膜是一种由微生物细胞和其分泌的胞外基质共同组成的生物聚集体，以其独特的微菌落形态和极高的环境抗性而受到人们的重视。在临床医学领域，超过80％的慢性感染疾病都与体内细菌形成生物膜有关，因此，有关致病性生物膜的研究早在上个世纪就已经开始。然而，作为生物膜的另一种存在形式——固定化发酵过程中细胞形成的生物膜却至今鲜有研究，尤其是固定化细胞成膜后表现出的较高底物耐受性和较快的发酵效率的机制机理到现在还不是很清楚。因此，本研究中我们选取模式菌株——酿酒酵母来考察固定化细胞在发酵阶段成膜的过程和成膜的分子机理。具体研究如下:　　首先，针对在传统游离发酵过程中细胞易受产物抑制、易退化的问题，我们发展了酵母的表面固定化技术来提高发酵的强度，成功实现了发酵过程的连续化和发酵效率的大幅提高。通常条件下，常规的游离细胞发酵50 g葡萄糖大约需要8个小时左右，而我们的固定化细胞只需要6个小时就可以将糖转化为乙醇。随着发酵批次的增加，固定化发酵体系会最终到达一个最佳稳定状态，此时的固定化细胞可以以4个小时的稳定发酵周期持续进行几十个批次的发酵，展现了固定化细胞出色的发酵效率和良好的发酵稳定性。在考察高浓度初糖条件下，固定化细胞与游离细胞的发酵表现实验中，我们发现，固定化细胞拥有比游离细胞更高的底物/产物耐受性。一般来说，超过200 g/L的葡萄糖就会对酵母细胞产生明显的毒害，而固定化细胞却可以在超过300 g/L的葡萄糖环境中保持较高的细胞活力和发酵性能。此外，通过对生物膜形成的可视化分析，我们还发现，酵母细胞在固定化介质表面存在一种“吸附-生长-发展-稳定”的生物膜形成过程，这为我们解释固定化细胞批次发酵前期发酵不稳定的问题提供了线索。　　其次，为了弄清生物膜的形成及环境抗性的机制机理，我们借助于全基因组转录分析手段对成膜后的细胞进行基因转录表达的分析。结果显示，在生物膜形成的粘附、固着和成熟三个阶段分别有2098、1556和927个基因发生了显著的调控表达。对这些差异表达的基因进行GO功能分析和KEGG富集分析后发现，和糖代谢、氨基酸代谢、能量代谢、信号调控路径等有关的基因在生物膜的形成过程中发挥着重要的作用。进一步的数据分析得出，在生物膜的形成初期，和糖信号调控有关的基因（Flo11、Mig1、Sip4、Nrg1，2、Hxt、Hxk等）发生了显著的异常表达;和糖异生有关的基因整体呈上调趋势，和糖酵解有关的基因全部下调，这充分说明了在酵母生物膜中糖代谢的重要作用。基于以上分析，我们提出了有关生物膜形成的代谢调控假说——“葡萄糖信号调控→糖异生作用→生物膜形成”。　　再次，为了研究和生物膜有关的基因的生物学功能，接下来我们通过分子生物学手段对调控生物膜形成的关键基因进行分子改造和基因修饰。利用长同源臂同源重组(LFH-PCR)技术，我们成功的构建了工业双倍体酿酒酵母1201的Flo11单基因敲除菌1201-FD、Mig1单基因敲除菌1201-MD以及Mig1双基因敲除菌1201-M，并对酵母野生菌和敲除菌进行细胞生长、成膜形态、invasive分析、固定化细胞乙醇敏感性等方面的分析。结果显示，和之前的文献中报道的一样，Flo11基因的敲除能造成生物膜形成的缺陷，并导致酵母细胞活性的减弱;与此同时，我们还发现了葡糖糖转录负调控因子Mig1基因的缺失也会对生物膜产生类似于Flo11基因突变株一样的生物学现象。这说明Mig1基因对酵母生物膜的形成起到关键的作用。　　通过本课题的研究，加深了我们对生物膜，尤其是固定化细胞成膜的认识，发展了工业微生物细胞成膜的研究方法，系统阐述了固定化细胞在发酵过程中细胞成膜的调控机制。本研究的意义不仅在于丰富和完善了生物膜理论体系的框架，还将促进有关固定化细胞技术和生物膜反应器的发展。