流行病学资料显示,全球约有6500万癫痫患者,其中高达四分之一的癫痫患者有认知功能障碍。在我国,约有超过600万癫痫患者,其中30%~40%存在认知功能障碍。癫痫患者认知功能障碍是多种因素综合作用的结果,包括癫痫本身(起病年龄、病程、发作频率、发作类型、癫痫灶部位)、抗癫痫药物、社会心理因素等。因大多数患者需长期口服抗癫痫药物,所以抗癫痫药物对癫痫患者的认知功能的影响一直是癫痫患者和临床医生所关注的问题。据报道,多数传统抗癫痫药物与癫痫患者的认知功能下降有关。然而,也有研究认为,与其它的传统抗癫痫药物比较,丙戊酸钠对认知功能的副作用较小。甚至有研究发现丙戊酸钠在动物模型中能够改善癫痫相关的学习和记忆功能下降。丙戊酸钠对认知功能的影响与剂量有关,大剂量的丙戊酸钠对认知功能有一定的损伤。动物实验研究表明,每日250-300mg/kg的丙戊酸钠在能够很好的控制癫痫的同时,不会对记忆力造成损伤。拉莫三嗪是一种相对新型的广谱抗癫痫药物。有研究报道,拉莫三嗪的抗癫痫效果不逊于丙戊酸钠,也同样具有对认知功能的影响较小的特点,但缺乏明确的剂量相关性研究。一般认为,增加抗癫痫药的剂量会增加认知损伤的风险。为了明确拉莫三嗪在癫痫治疗中是否会损伤认知功能,我们以每日300mg/kg丙戊酸钠治疗组作为阳性对照,观察了不同剂量拉莫三嗪对戊四氮点燃大鼠的抗癫痫作用,并进一步通过水迷宫实验、海马CA1区和CA3区TUNEL染色,比较了接受不同剂量拉莫三嗪治疗的戊四氮点燃大鼠在水迷宫实验、海马CA1区和CA3区TUNEL染色结果差异,通过观察在达到最大抗癫痫作用的基础上,增加拉莫三嗪的剂量对戊四氮点燃大鼠学习记忆功能和海马神经元凋亡的影响,讨论了拉莫三嗪对认知功能的影响。为了进一步探讨癫痫导致海马神经元凋亡的信号传导通路,我们观察了JAK-STAT通路中的STAT3蛋白在戊四氮点燃大鼠海马组织中的表达及活化,并通过比较拉莫三嗪和丙戊酸钠治疗后STAT3蛋白在海马组织中的变化,讨论了STAT3在海马组织中表达及活化的意义。第一部分不同剂量拉莫三嗪对戊四氮点燃大鼠的抗癫痫作用比较目的:建立戊四氮点燃大鼠模型,观察低、中、高剂量拉莫三嗪对戊四氮点燃大鼠癫痫发作等级的影响,评价不同剂量拉莫三嗪的抗癫痫作用。方法:取8-12周清洁级健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,给予35mg/kg 1%戊四氮隔日经腹腔注射,共13次,以制备戊四氮点燃模型。以3.5ml/kg 0.9%氯化钠用同样的方法隔日腹腔注射,以制备非癫痫组(Sham组)模型。注射完毕后观察半小时,采用Racine分级对癫痫等级(seizure stage)进行进行评估。Racine分级标准为:0级:无抽搐发作,行为状态无明显异常;1级:湿狗样抖动,面部抽搐如眨眼、动须及节律性咀嚼;2级:颈部肌肉痉挛表现为点头或甩尾;3级:一侧前肢阵挛;4级:双侧前肢阵挛,伴站立;5级:全身阵挛,失去平衡,跌倒。癫痫组大鼠在连续2次注射戊四氮后Racine分级均达到3级及以上视为成功点燃。在大鼠点燃模型制备完成48小时后,将成功点燃的大鼠随机分为5个治疗组:对照组(CON组):每日腹腔注射3.5ml/kg 0.9%氯化钠,共2周;低剂量拉莫三嗪组(L-LTG组):每日腹腔注射12.5mg/kg拉莫三嗪,共2周;中剂量拉莫三嗪组(M-LTG):每日腹腔注射25mg/kg拉莫三嗪,共2周;高剂量拉莫三嗪组(H-LTG):每日腹腔注射50mg/kg拉莫三嗪,共2周;丙戊酸钠组(VPA组):每日腹腔注射300mg/kg丙戊酸钠,共2周。对于非癫痫组(Sham组)大鼠每日给予3.5ml/kg 0.9%氯化钠腹腔注射,共2周。上述治疗的同时,对于点燃大鼠继续给予35mg/kg 1%戊四氮隔日腹腔注射以保持点燃状态。观察治疗后各组大鼠的癫痫发作分级的差异。结果:对照组(CON组)、低剂量拉莫三嗪治疗组(L-LTG组)、中剂量拉莫三嗪治疗组(M-LTG组)、高剂量拉莫三嗪治疗组(H-LTG组)和丙戊酸钠治疗组(VPA组)在治疗前平均癫痫发作分级没有显著差异(F[4,541]=0.623,P=0.646)。各组在治疗后平均癫痫发作分级有显著差异(F[4,289]=29.996,P=0.000)。拉莫三嗪和丙戊酸钠治疗组的平均癫痫分级与对照组(CON组)比较显著下降(P<0.05)。中剂量拉莫三嗪治疗组(M-LTG组)和高剂量拉莫三嗪治疗组(H-LTG组)的癫痫分级与低剂量拉莫三嗪治疗组(L-LTG组)比较显著下降(P<0.05)。结论:拉莫三嗪可显著降低戊四氮点燃大鼠的癫痫发作分级。中剂量拉莫三嗪(每日25mg/kg)和高剂量拉莫三嗪(每日50mg/kg)对戊四氮点燃大鼠的抗癫痫作用优于低剂量拉莫三嗪(每日12.5mg/kg),高剂量拉莫三嗪(每日50mg/kg)对戊四氮点燃大鼠的抗癫痫作用与中剂量拉莫三嗪(每日25mg/kg)比较没有显著差异。第二部分不同剂量拉莫三嗪在戊四氮点燃大鼠的抗癫痫治疗中对认知功能的影响目的:通过比较接受不同剂量拉莫三嗪治疗的戊四氮点燃大鼠在水迷宫实验中逃避潜伏期和空间探索能力的差异,分析拉莫三嗪在抗癫痫治疗中对认知功能损伤的影响。方法:取8-12周清洁级健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,给予35mg/kg 1%戊四氮隔日经腹腔注射,共13次,以制备戊四氮点燃模型。以3.5ml/kg 0.9%氯化钠用同样的方法隔日腹腔注射,以制备非癫痫组(Sham组)模型。注射完毕后观察半小时,采用Racine分级对癫痫等级进行进行评估。癫痫组大鼠在连续2次注射戊四氮后Racine分级均达到3级及以上视为成功点燃。在大鼠点燃模型制备完成48小时后,将成功点燃的大鼠随机分为5个治疗组:对照组(CON组):每日腹腔注射3.5ml/kg0.9%氯化钠,共2周;低剂量拉莫三嗪组(L-LTG组):每日腹腔注射12.5mg/kg拉莫三嗪,共2周;中剂量拉莫三嗪组(M-LTG):每日腹腔注射25mg/kg拉莫三嗪,共2周;高剂量拉莫三嗪组(H-LTG):每日腹腔注射50mg/kg拉莫三嗪,共2周;丙戊酸钠组(VPA组):每日腹腔注射300mg/kg丙戊酸钠,共2周。对于非癫痫组(Sham组)大鼠每日给予3.5ml/kg 0.9%氯化钠腹腔注射,共2周。上述治疗的同时,对于点燃大鼠继续给予35mg/kg 1%戊四氮隔日腹腔注射以保持点燃状态。在治疗的第10天开始进行水迷宫实验。水迷宫实验共进行5天,每天需要分别从4个象限入水进行实验。前4天为定位航行实验,测试大鼠的学习能力。将大鼠在随机选定象限桶壁的中点面朝桶壁轻轻放入水中,在找到平台以后,记录大鼠从入水到爬上平台的时间,即逃避潜伏期(escape latency),在平台休息30秒后再从其它象限以同样的方式入水进行试验。如果大鼠在120秒内没有找到平台,将大鼠放置于平台上休息30秒再进行下面的试验,逃避潜伏期则计为120秒。在第5天进行空间探索实验,测试大鼠的空间记忆能力。撤去平台,大鼠以与前面相同的方式入水,记录大鼠在120秒内通过原来放置平台位置的次数(spatial probe frequency)。结果:在水迷宫实验的第1天和第2天,各组的逃避潜伏期没有显著差异(F[5,46]=0.974,P=0.444;(F[5,46]=1.021,P=0.417)。然而,在水迷宫实验第3天和第4天,各组之间的逃避潜伏期有显著差异((F[5,46]=2.988,P=0.020;F[5,46]=2.942,P=0.022)。Sham组的逃避潜伏期显著低于对照组(CON组)(P<0.05)。中剂量拉莫三嗪治疗组(M-LTG组)、高剂量拉莫三嗪治疗组(H-LTG组)和丙戊酸钠治疗组(VPA组)的逃避潜伏期与对照组(CON组)比较显著下降(P<0.05),但是低剂量拉莫三嗪治疗组(L-LTG组)与对照组(CON组)比较没有显著差异(P>0.05)。在水迷宫实验第5天,各组在空间探索实验中表现有显著差异(F[5,46]=4.721,P=0.001)。Sham组在空间探索实验中通过原平台的次数显著多于对照组(CON组)。与对照组(CON组)比较,中剂量拉莫三嗪治疗组(M-LTG组)、高剂量拉莫三嗪治疗组(H-LTG组)和丙戊酸钠治疗组(VPA组)通过原平台位置的次数显著增多(P<0.05)。然而,低剂量拉莫三嗪治疗组(L-LTG组)在空间探索试验中通过原平台位置的次数与对照组(CON组)比较没有显著差异(P>0.05)。结论:戊四氮点燃大鼠在水迷宫实验中的学习记忆能力受损。中剂量拉莫三嗪(每日25mg/kg)和高剂量拉莫三嗪(每日50mg/kg)在对戊四氮点燃大鼠的抗癫痫治疗中可显著改善戊四氮点燃大鼠的学习记忆能力;在达到最大抗癫痫作用(每日25mg/kg)的基础上,增加拉莫三嗪剂量(每日50mg/kg)没有加重戊四氮点燃大鼠在水迷宫实验中的学习记忆能力损伤。第三部分不同剂量拉莫三嗪对戊四氮点燃大鼠海马CA1区和CA3区神经元凋亡的影响目的:通过比较接受不同剂量拉莫三嗪治疗的戊四氮点燃大鼠海马CA1区和CA3区TUNEL染色结果的差异,分析了拉莫三嗪对戊四氮点燃大鼠海马CA1区和CA3区神经元凋亡的影响。方法:取8-12周清洁级健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,给予35mg/kg 1%戊四氮隔日经腹腔注射,共13次,以制备戊四氮点燃模型。以3.5ml/kg 0.9%氯化钠用同样的方法隔日腹腔注射,以制备非癫痫组(Sham组)模型。注射完毕后观察半小时,采用Racine分级对癫痫等级进行进行评估。癫痫组大鼠在连续2次注射戊四氮后Racine分级均达到3级及以上视为成功点燃。在大鼠点燃模型制备完成48小时后,将成功点燃的大鼠随机分为5个治疗组:对照组(CON组):每日腹腔注射3.5ml/kg0.9%氯化钠,共2周;低剂量拉莫三嗪组(L-LTG组):每日腹腔注射12.5mg/kg拉莫三嗪,共2周;中剂量拉莫三嗪组(M-LTG):每日腹腔注射25mg/kg拉莫三嗪,共2周;高剂量拉莫三嗪组(H-LTG):每日腹腔注射50mg/kg拉莫三嗪,共2周;丙戊酸钠组(VPA组):每日腹腔注射300mg/kg丙戊酸钠,共2周。对于非癫痫组(Sham组)大鼠每日给予3.5ml/kg 0.9%氯化钠腹腔注射,共2周。上述治疗的同时,对于点燃大鼠继续给予35mg/kg 1%戊四氮隔日腹腔注射以保持点燃状态。拉莫三嗪或丙戊酸钠治疗2周后,大鼠在深麻醉下处死并留取脑组织,将脑组织标本保存在4%多聚甲醛过夜,脑组织经石蜡包埋处理后做4μm厚的连续切片,取包含海马组织的切片进行TUNEL染色。石蜡包埋的海马组织切片经常规脱蜡脱水后,用蛋白酶K(20μg/ml溶于Tris/HCl中,Ph7.4~8.0)室温孵育15~30分钟,37℃孵育15分钟,然后用PBS冲洗2次,擦干样品周围的水,滴加50ul的TUNEL反应混合溶液,在湿盒中37℃孵育60分钟(为防止蒸发和保证TUNEL反应混合物均匀分布,在孵育过程中加盖盖玻片),然后用PBS冲洗3次,擦干样品周围的水分,加入50ul转化剂-POD,在湿盒中37℃孵育30分钟(为防止蒸发和保证转化剂-POD均匀分布,在孵育过程中加盖盖玻片)。PBS冲洗3次,加入50~100μl DAB底物溶液,室温孵育10分钟,PBS冲洗3次。苏木素复染细胞核,封片,在光镜下图象分析,计数五个视野中TUNEL阳性细胞所占的百分比为凋亡率(apoptosis rate)。结果:各组海马CA1区神经元凋亡率有显著差异(F[5,19]=4.386,P=0.008),但是各组CA3区神经元凋亡率没有显著差异(F[5,19]=2.326,P=0.083)。对照组(CON组)CA1区和CA3区神经元凋亡率显著高于Sham组(P<0.05)。中剂量拉莫三嗪治疗组(M-LTG组)、高剂量拉莫三嗪治疗组(H-LTG组)和丙戊酸钠治疗组(VPA组)海马CA1区神经元凋亡率显著低于对照组(CON组)(P<0.05)。低剂量拉莫三嗪治疗组(L-LTG组)海马CA1区神经元凋亡率与对照组(CON组)比较没有显著差异(P>0.05)。各拉莫三嗪治疗组(L-LTG组、M-LTG组和H-LTG组)和丙戊酸钠治疗组(VPA组)CA3区神经元凋亡率与对照组(CON组)比较没有显著差异(P>0.05)。结论:戊四氮点燃大鼠海马CA1区和CA3区存在显著神经元凋亡。中剂量拉莫三嗪(每日25mg/kg)和高剂量拉莫三嗪(每日50mg/kg)在对戊四氮点燃大鼠的抗癫痫治疗中可以显著减轻海马CA1区神经元凋亡,但是没有显著改善CA3区神经元凋亡;在达到最大抗癫痫作用(每日25mg/kg)的基础上,增加拉莫三嗪剂量(每日50mg/kg)没有加重戊四氮点燃大鼠CA1区神经元凋亡。第四部分拉莫三嗪对戊四氮点燃大鼠海马组织STAT3表达的影响目的:通过比较各组海马组织中STAT3及P-STAT3水平的差异,观察了戊四氮点燃对海马组织中STAT3蛋白表达的影响以及应用拉莫三嗪治疗后海马组织中STAT3蛋白表达的变化。方法:取8-12周清洁级健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,给予35mg/kg 1%戊四氮隔日经腹腔注射,共13次,以制备戊四氮点燃模型。以3.5ml/kg 0.9%氯化钠用同样的方法隔日腹腔注射,以制备非癫痫组(Sham组)模型。注射完毕后观察半小时,采用Racine分级对癫痫等级进行进行评估。癫痫组大鼠在连续2次注射戊四氮后Racine分级均达到3级及以上视为成功点燃。在大鼠点燃模型制备完成48小时后,将成功点燃的大鼠随机分为5个治疗组:对照组(CON组):每日腹腔注射3.5ml/kg0.9%氯化钠,共2周;低剂量拉莫三嗪组(L-LTG组):每日腹腔注射12.5mg/kg拉莫三嗪,共2周;中剂量拉莫三嗪组(M-LTG):每日腹腔注射25mg/kg拉莫三嗪,共2周;高剂量拉莫三嗪组(H-LTG):每日腹腔注射50mg/kg拉莫三嗪,共2周;丙戊酸钠组(VPA组):每日腹腔注射300mg/kg丙戊酸钠,共2周。对于非癫痫组(Sham组)大鼠每日给予3.5ml/kg 0.9%氯化钠腹腔注射,共2周。上述治疗的同时,对于点燃大鼠继续给予35mg/kg 1%戊四氮隔日腹腔注射以保持点燃状态。拉莫三嗪或丙戊酸钠治疗2周后,大鼠在深麻醉下断头处死并快速分离出海马组织。将离体海马组织在加入蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中匀浆处理,应用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。根据蛋白定量结果,加入50μg相应体积的总蛋白样品与5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液,变性处理后电泳、转膜,将转移膜置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭1小时,然后将封闭后的膜放入一抗工作液(STAT3 1:1000 P-STAT3 1:1000 actin 1:1000)中,4℃反应过夜,然后将反应膜用1×TBST洗涤三次,将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液(山羊抗兔1:5000,山羊抗小鼠1:5000)中,室温、避光缓慢摇动作用60分钟,洗去游离二抗。最后采用ECL化学发光法进行条带显影,曝光后对条带进行分析。结果:各组海马组织中STAT3蛋白水平存在显著差异(F[5,18]=35.647,P=0.000),P-STAT3蛋白水平存在显著差异(F[5,18]=50.737,P=0.000)。对照组(CON组)海马组织中STAT3蛋白及P-STAT3蛋白水平与Sham组比较显著升高(P<0.05)。低剂量拉莫三嗪组(L-LTG组)、中剂量拉莫三嗪治疗组(M-LTG组)、高剂量拉莫三嗪治疗组(H-LTG组)和丙戊酸钠治疗组(VPA组)海马组织中STAT3及P-STAT3蛋白水平与Sham组比较显著升高(P<0.05)。中剂量拉莫三嗪治疗组(M-LTG组)、高剂量拉莫三嗪治疗组(H-LTG组)和丙戊酸钠治疗组(VPA组)海马组织中STAT3及P-STAT3蛋白水平与对照组(CON组)比较显著下降(P<0.05)。低剂量拉莫三嗪组(L-LTG组)海马组织中STAT3及P-STAT3蛋白水平与对照组(CON组)比较没有显著差异(P>0.05)。结论:戊四氮点燃大鼠海马组织STAT3及P-STAT3蛋白水平显著升高。中剂量拉莫三嗪(每日25mg/kg)和高剂量拉莫三嗪(每日50mg/kg)在对戊四氮点燃大鼠的抗癫痫治疗中可使海马组织STAT3及P-STAT3蛋白水平显著下降。低剂量拉莫三嗪(每日12.5mg/kg)对戊四氮点燃大鼠海马组织STAT3及P-STAT3蛋白水平没有显著影响。