目的:在琼脂平板及肉汤中验证磷霉素对大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853的耐药突变选择窗(mutant selection window,MSW)理论。进一步在兔组织笼模型中测定磷霉素对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的MSW,并通过统计学分析获得与防耐药突变相关的药代动力学/药效学(pharmacokinetic/pharmacodynamics,PK/PD)参数。通过检测体外诱导的耐药突变体在肉汤和组织液中生长速率的变化以及耐药菌和亲代菌竞争性生长实验,拟解释大肠埃希菌在体内外诱导耐药实验中相互矛盾的结果。材料与方法:.大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853由安徽省细菌耐药性监控中心保存;体重2.5-3kg雌性新西兰白兔60只由安徽医科大学实验动物中心提供。采用琼脂二倍稀释法测定大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853对磷霉素的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)值。肉汤法富集浓度为3×1010CFU/ml的大肠埃希菌ATCC25922或铜绿假单胞菌ATCC27853,取菌液100μl用L棒均匀涂布在含有系列倍比稀释浓度的磷霉素和25μg/mL6-磷酸葡萄糖的Mueller-Hinton(MH)琼脂平板上,每个药物浓度接种4个平板使得接种的细菌总量为1.2×l010CFU/ml,35℃培养72h后无菌落生长的最低药物浓度即为该药的初测防耐药突变浓度(mutant prevention concentration,MPC)。为描绘磷霉素药物浓度对大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853的恢复生长曲线,将细菌均匀接种于系列浓度的含药平板上,培养24h后计数平板上恢复生长的细菌数量。采用修正的时间杀菌曲线评估磷霉素对大肠埃希菌及铜绿假单胞菌的高载量杀菌活性。将待测菌(~1010cfu/ml)加入含有系列药物浓度(0.5×,4×,8×,16×,32×mic)和25μg/ml6-磷酸葡萄糖的mh肉汤中,35℃培养。分别在0,4,8,12,24和48h从锥形瓶中吸取100μl培养液进行平板计数。对随机选取的18株体外诱导的磷霉素耐药突变菌(包括9株大肠埃希菌和9株铜绿假单胞菌)及其亲代菌进行耐药基因的比对检测。提取每株细菌的染色体dna,并采用聚合酶链反应(polymerasechainreaction,pcr)扩增并测序突变菌mura、glpt、uhpt、uhpa、ptsi和cyaa基因,以检测其变异情况。建立兔组织笼感染模型。感染3天后给予每天三次的不同药物剂量的磷霉素钠静脉滴注治疗,以期组织笼内的药物浓度位于mic值以下,mic值和mpc值之间以及mpc值以上。采用气相色谱法测定组织液中的磷霉素药物浓度。采用graphpadprism5.01软件对测定的磷霉素药物浓度数据按照非房室模型进行处理,计算出相关药代动力学参数。每只兔子治疗前,治疗期间每24h及治疗结束后的24h、48h及72h时从组织笼内抽取组织液500μl,测定其中细菌的浓度。将采集的标本用生理盐水进行10倍倍比稀释,分别取100μl的适当浓度的稀释液接种于不含药物mh琼脂平板上,37℃培养24小时,进行菌落计数。为排除样本中的抗菌药物对其中细菌生长的抑制作用,每份样品均经过充分稀释,以保证其中的药物浓度处于mic值以下,检测的细菌浓度的低限为2log10cfu/ml。监测治疗过程中的细菌对磷霉素敏感性的变化。采用平板计数法计数原培养液中细菌的总数量,之后选择含有细菌数量较多的计数平板,将表面细菌悬浮于5ml生理盐水中,并将菌液浓度调整为1.0×108cfu/ml,再次接种于含有4×mic磷霉素药物浓度及25μg/ml的6-磷酸葡萄糖的mh平板上,置35℃培养18~20h后观察平板上细菌生长情况。若平板上恢复生长细菌的数量与原培养液中细菌数量的比值较未治疗组增加>1log10则认为原培养液中已有耐药突变菌富集。同时采用标准方法对上述样本进行mic值的检测。根据pk/pd参数将实验中的兔子进行分组,对每组间出现的耐药突变频率进行fisher精确检验。以实验中生理盐水对照组为参照,p<0.05时认为两组间的差异有统计学意义。将从体外诱导产生的耐药突变菌及亲代菌分别接种于50ml无菌mh肉汤中,35℃过夜培养。取1ml培养液置于10ml新鲜肉汤中35℃培养,或将1ml培养液用无菌注射器接种于兔组织笼模型中。接种后分别于0h、2h、4h、6h抽取100μl培养液或组织液进行平板菌落计数。以时间为横坐标,细菌浓度为纵坐标绘制细菌生长曲线。将耐药突变菌与亲代菌按照1:1的比例接种于5只兔组织笼模型中,24h后采用生理盐水或300mg/kg/day的磷霉素剂量予以抗感染治疗。48h后采用平板计数法分别计算组织液中耐药菌和敏感菌的浓度,并计算竞争指数(competitionindex,ci)。结果:磷霉素对大肠埃希菌atcc25922的mic和mic99分别为2μg/ml和1.2μg/ml。磷霉素对铜绿假单胞菌atcc27853的mic和mic99分别为4μg/ml和3.6μg/ml。磷霉素对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的mpc值分别为57.6μg/ml和102.4μg/ml。在体外时间杀菌曲线显示磷霉素并没有表现出较快的杀菌能力。当肉汤中的药物浓度位于4×,8×,16×mic时,大肠埃希菌和铜绿假单胞菌在12h后都出现了快速的恢复生长。杀菌实验结束时,在这些磷霉素浓度组的培养液中均发现了伴有mic显著增高的突变菌。但这种由耐药突变导致的恢复生长现象并没有在最低浓度组(0.5×mic)和最高浓度组(32×mic)出现。体外诱导的18株突变菌均展现了对磷霉素不同程度的耐药(mic范围:8~>1024μg/ml)。耐药基因的pcr扩增和测序显示9株大肠埃希菌中有8株发生了包括glpt、uhpt、uhpa、ptsi和(或)cyaa基因位点的突变,而9株铜绿假单胞菌中有5株发生了glpt基因位点的突变。在体内msw研究中,磷霉素剂量在100mg/kg/day到900mg/kg/day的治疗组在最初对铜绿假单胞菌的生长有一定程度的抑制,但随后2到3天内发生了细菌恢复生长的现象。此时,磷霉素药物浓度刚好位于msw以内,组织液中在含药平板上恢复生长的细菌数量显著增加,而其对磷霉素的敏感性显著降低。统计学分析显示当药物浓度位于MPC以上的时间达到70%以上或药代动力学参数AUC24/MPC>10时,能够有效的防止上述体内耐药突变菌选择性富集。但对于大肠埃希菌感染组,无论磷霉素药物浓度位于MSW以内或以外,在治疗过程中或治疗结束后均无法观察到细菌恢复生长或耐药菌产生的现象。细菌生长曲线显示,大肠埃希菌耐药突变体相对于亲代菌ATCC 25922在体内外的生长均明显缓慢。并且在体内竞争性实验中,突变菌的生长明显被处于优势的敏感菌所抑制。而对于铜绿假单胞菌,耐药突变菌和亲代菌在生长速率和竞争性生长方面均未发现明显的区别。结论:在体外琼脂平板测得的MSW与兔组织笼模型内测得的一致,因此MSW理论适用于磷霉素对铜绿假单胞菌。对于大肠埃希菌,当磷霉素药物浓度位于MSW以内时,对磷霉素耐药的突变体只能在体外被诱导,而突变菌的选择性富集并没有在兔组织笼感染模型中观察到。一些特殊的因素,如大肠埃希菌耐药突变后生物适应性的下降和宿主的免疫反应是产生这一现象潜在的原因。