随着载人航天发展及空间站相关任务的持续推进,要求航天员在轨驻留的时间越来越长。在长期的太空飞行中,航天员由于所处的特殊环境,包括微重力、噪声、生物节律改变和狭小空间等,都会对航天员的心理、生理等身心健康产生一定的影响,从而影响其工作能力的发挥。因此,为确保航天员在长期空间飞行中健康、安全和高效的工作而开展的相关研究已成为航天医学领域的研究热点和难点。目前,航天复合环境对航天员机体和脑功能影响的研究相对滞后。针对上述问题以及未来航天发展的需求,从航天复合环境对精神行为影响的角度出发,建立航天复合环境下大鼠模型,采用精神行为学实验指标、定量蛋白质组学和质谱多反应监测技术,从蛋白整体水平研究并阐明航天复合环境对航天员脑功能的影响具有十分重要的意义。本研究通过模拟微重力环境和航天复合环境两个层次的太空飞行环境,从行为学、海马线粒体蛋白、海马细胞膜蛋白和神经递质等四个方面,对两种环境下对大鼠海马的影响进行评价,为探讨太空复合环境对航天员的精神健康影响提供科学数据。本论文主要研究内容分为二个层面。一方面,建立单独模拟微重力效应的大鼠模型,监测大鼠脑内生理生化指标的变化情况,并结合18O标记的定量蛋白质组学技术,鉴定模型组和对照组大鼠海马细胞膜及线粒体的差异蛋白,探讨模拟微重力效应对大鼠精神行为影响的作用机制。另一方面,建立模拟航天复合环境(模拟微重力,噪声,生物节律改变,狭小空间)多重因素影响的大鼠模型,探索该模型对大鼠精神行为的影响,利用18O标记和非标的“SWATH定量”蛋白质组学技术,从蛋白水平揭示航天复合环境对大鼠海马脑区的影响。综合两个层次的工作,本研究取得了以下几个成果:1成功建立了中长期模拟微重力效应的大鼠模型并进行了模型评价。采用大鼠吊尾21天模型模拟中长期微重力效应,通过对动物进行日均摄食、体重和行为学分析,发现模拟中长期微重力下模型组大鼠的日均摄食和体重较正常组分别变化0.51%和0.75%,可以真实地模拟微重力效应,提示模型构建成功。在糖水实验中模拟微重力组糖水偏爱率与对照组无显著性差异(p>0.05),强迫游泳静止飘浮时间无显著性差异(p>0.05),而模拟跨格次数和直立次数显著低于对照组(p<0.05)。中央格停留时间明显减少(p<0.05),自我修饰和粪便颗粒明显增多(p<0.05),表明模拟微重力21天使大鼠产生一定程度的焦虑。吊尾21天大鼠海马的脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde,mda)和过氧化氢(h2o2)含量与正常组相比明显升高,而超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)的含量与正常组相比明显降低(p<0.05),表明中长期模拟微重力效应下大鼠海马出现了氧化应激。因此,可以大鼠的平均日摄食、体重和氧化应激的指标变化进行中长期模拟微重力的模型评价。2从蛋白层面上进一步确证了中长期模拟微重力效应产生氧化应激的损伤并使能量代谢发生紊乱。采用18o标记的定量蛋白质组学分析大鼠海马线粒体蛋白的变化,当肽段假阳性率fdr<1%,肽段得分spi=15时,共鉴定到679个蛋白,其中差异蛋白42个,上调21个,下调21个。这些差异蛋白主要富集在(1)氧化磷酸化过程受损(线粒体复合体i、iii和iv的蛋白表达下调);(2)三羧酸循环(tca)催化过程受损(异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶表达下调);(3)脂肪酸的氧化紊乱(长链脂肪酸辅酶a连接蛋白亚基6表达上调、极长链乙酰辅酶a脱氢酶、乙酰辅酶a合成酶家族蛋白2和脂肪酸酰胺水解酶表达下调)。部分蛋白在已有的微重力研究中未被报道过。同时抗氧化蛋白dj-1和过氧化物氧化还原酶6表达上调,可能与细胞内的代偿效应相关。westernblot验证了dj-1和cox5a的表达,与质谱结果一致。3模拟微重力影响了大鼠海马神经递质的释放和清除,兴奋性递质谷氨酸浓度过度升高,抑制性递质r-氨基丁酸合成减弱,可能对神经元产生一定的毒性损伤。采用18o标记的定量蛋白质组分析了大鼠海马细胞膜蛋白的变化,当肽段fdr<1%,spi=15时,共鉴定到863个蛋白,其中差异蛋白53个,上调31个,下调22个。这些差异蛋白主要富集在(1)snare复合体形成受到干扰(囊泡相关膜蛋白3和突触融合蛋白-1a表达下调);(2)突触囊泡回收受到影响(突触融合蛋白-结合蛋白5和小g蛋白rab3a表达下调,效应分子rim2表达上调);(3)突触间隙的谷氨酸清除受到影响(神经胶质细胞的谷氨酸的转运体1表达下调,囊泡谷氨酸转运蛋白1和2表达上调);(4)氨基丁酸合成受到影响(谷氨酸脱羧酶1和谷氨酸脱羧酶2表达下调)。蛋白质组学结果提示谷氨酸的清除和r-氨基丁酸的合成受到影响。而兴奋性谷氨酸过度增加和抑制性r-氨基丁酸过度减弱均会给神经元造成损伤。同时,以质谱多反应监测(multiplereactionmonitoring,mrm)的方法分析了脑内神经递质的含量,结果发现中长期微重力组大鼠海马兴奋性神经递质谷氨酸浓度101.60μg/mg较正常组85.29μg/mg明显升高(p<0.05),而抑制性神经递质r-氨基丁酸27.69μg/mg与正常组37.64μg/mg相比明显下降(p<0.05),这一结果和谷氨酸转运体和谷氨酸脱羧酶的变化趋势一致,进一步证实模拟微重力影响了大鼠海马神经递质的释放和清除过程。westernblot验证了psd-95的表达,与质谱结果一致。4成功建立了模拟航天复合环境的大鼠模型并进行了模型评价。在21天吊尾模型的基础上复合噪声(65db),生物节律改变(1.5h)及狭小空间三个因素模拟航天员长期航天飞行中所处的复杂舱室环境,对动物进行日均摄食、体重和行为学分析,发现模拟航天复合环境下模型组大鼠的日均摄食量与对照组相比减少4.2%,体重与对照组相比减少5.9%。模拟航天复合环境下模型组大鼠在糖水实验中其糖水偏爱率与对照组相比明显降低(p<0.05),强迫游泳静止飘浮时间显著减少(p<0.05),模型组动物在旷场实验中跨格次数与直立次数也明显减少(p<0.05),中央停留的时间也明显低于对照组(p<0.05),而自我修饰和粪便颗粒数明显高于对照组(p<0.05),表明模拟航天复合环境下大鼠情绪出现了抑郁样改变。5模拟航天复合环境下大鼠海马线粒体能量代谢出现紊乱。采用18o标记的差异蛋白质组学,对模拟航天复合环境模型大鼠海马线粒体进行差异蛋白质组学分析,结果显示当肽段fdr<1%,spi=15时,共鉴定到515个蛋白,其中差异蛋白89个,12个蛋白表达上调,77个蛋白表达下调。发现这些差异蛋白主要富集在氧化磷酸化(线粒体复合体i、iii和v的蛋白均表达下调)和三羧酸循环(丙酮酸脱氢酶复合体的亚基和乌头酸水合酶表达下调)的生物学过程。6模拟航天复合环境影响了大鼠海马的内质网蛋白加工、突触的囊泡转运和神经突触传递过程,兴奋性递质谷氨酸浓度增加,抑制性递质r-氨基丁酸减少,可能对神经元产生一定的毒性损伤。采用非标的swath定量蛋白质组学方法,对模拟航天复合环境大鼠模型中海马细胞膜蛋白进行差异蛋白质组学分析。当肽段<1%fdr时,共鉴定到4520个定量蛋白。其中差异蛋白1112个蛋白,812个蛋白表达上调,300个蛋白表达下调。发现模拟航天复合环境影响了与sec61、sec62等蛋白相关的内质网蛋白加工过程,与ap180、ap2激酶、dynamin-1、clathrin-lightchain等蛋白相关的突触的囊泡转运和与psd-95、neurexin2、neuroligin-1等蛋白相关的神经突触传递过程。通过质谱mrm方法发现模拟航天环境组大鼠海马兴奋性神经递质谷氨酸浓度154.38μg/mg较正常组85.68μg/mg明显升高(p<0.05),而抑制性神经递质r-氨基丁酸15.42μg/mg与正常组36.44μg/mg相比明显下降(p<0.05)。这些变化均提示模拟航天复合环境可能会对大鼠海马神经元产生一定的损伤。westernblot验证了gsk-3的表达,与质谱结果一致。7模拟航天复合环境对大鼠脑神经的影响较单独模拟微重力的环境相比,影响更为严重。从行为学、海马线粒体蛋白、海马细胞膜蛋白和神经递质等四个方面对以上两种环境下大鼠的精神行为进行评价,发现航天复合环境对大鼠海马的影响更为严重。综上所述,本研究针对载人航天发展的未来需求,以提升航天员的适应能力、决策能力为目标,通过模拟两个层次的太空飞行环境,即单独模拟微重力环境和航天复合环境,建立了模拟航天复合环境对精神行为复合因素影响的动物模型,并结合蛋白质组学相关技术,探寻航天复合环境对人的精神行为影响的重要分子机制,为未来航天复合环境设计,改善航天员保护措施提供基础研究数据。这项研究同时也对地球上精神类疾病发病机制的探讨具有重要意义。