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CAR T细胞免疫疗法的出现,是人类癌症治疗领域的一个重要里程碑。CAR T细胞在血液系统恶性肿瘤中疗效显著,但其在实体肿瘤治疗过程中依然面临着巨大挑战,因此提高CAR T细胞在实体瘤中的疗效是目前急需解决的重大科学前沿问题。NKG2D是一种主要表达于NK细胞的激活性免疫受体,与配体结合后可激活NK细胞,进而释放细胞毒性颗粒和细胞因子发挥杀伤作用。由于NKG2D的配体在多种肿瘤中高表达,以NKG2D作为靶向分子的CAR T细胞治疗NKG2D配体高表达的肿瘤成为一种很有前途的免疫治疗方法。前列腺癌是一种上皮组织恶性肿瘤,其发病率高,复发和转移风险较大,且目前治疗转移性前列腺癌的手段非常有限,因此亟需新的安全有效的策略来治疗转移性前列腺癌。本研究中我们发现前列腺肿瘤细胞高表达NKG2D的配体,通过细胞毒性实验检测发现NKG2D-CAR T细胞对三种前列腺癌细胞系均有杀伤效果,表明使用NKG2D-CAR靶向治疗前列腺癌是一种可行有效的方法。然而和大多数实体肿瘤一样,前列腺肿瘤尤其是发生转移的肿瘤,具有强大的免疫抑制微环境,能够抑制CAR T细胞的增殖、存活和抗肿瘤效应,因此本研究在NKG2D-CAR T细胞的基础上,通过共表达IL-7或下调GPR116的表达来增强CAR T细胞的增殖、存活和抗肿瘤功能,进而为提高前列腺癌以及更多实体瘤的疗效提供新的思路和潜在靶点,为临床应用和疾病治疗提供理论依据。第一部分共表达细胞因子IL-7增强NKG2D-CAR T细胞抗前列腺癌的研究细胞因子IL-7作为一种细胞生长因子,具有促进T细胞增殖、存活以及维持记忆性T细胞生长等功能。为了探究IL-7在CAR T细胞功能中的调控作用及机制,我们制备了共表达IL-7的NKG2D-CAR T细胞,检测发现NKG2DIL7-CAR T细胞具有更高的活化水平以及更强的杀伤前列腺癌PC-3细胞的能力。之后我们对两种CAR T细胞的增殖、凋亡和耗竭等功能进行了检测,结果表明,与靶细胞共培养后,相比于NKG2D-CAR T细胞,NKG2DIL7-CAR T细胞的增殖能力更强,CD8~+T细胞亚群的比例更高,并且凋亡细胞比例降低,胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达升高,且其主要由CD8~+T细胞中Bcl-2的表达升高导致。我们还发现NKG2DIL7-CAR T细胞表达更低水平的耗竭分子PD-1和Tim-3,且Tscm样细胞比例更高,以上结果均预示着NKG2DIL7-CAR T细胞具有更强的抗肿瘤功能。我们进一步利用免疫缺陷小鼠的前列腺癌模型进行验证,相比于未治疗组,两种CAR T细胞均有明显的抗肿瘤效果,而NKG2DIL7-CAR T细胞的效果更显著,肿瘤组织中T细胞的积累更明显,且CD8~+T细胞比例更高。综上,本研究表明共表达IL-7能够增强NKG2D-CAR T细胞的杀伤、增殖和存活,降低NKG2D-CAR T细胞的凋亡和耗竭,进而增强NKG2D-CAR T细胞抗前列腺癌的效果。本研究为增强CAR T细胞的抗肿瘤效应提供了一种新的思路,也为提高前列腺癌及更多实体瘤的治疗提供了一种新的线索和方向。第二部分下调GPR116的表达增强NKG2D-CAR T细胞抗前列腺癌的研究研究报道,黏附性G蛋白偶联受体GPR116能够参与免疫系统的调节,但其具体功能及机制尚不清楚。前期实验我们发现,与野生型小鼠相比,Gpr116敲除小鼠的脾脏显著增大,且脾脏中CD8~+T细胞激活后分泌更高水平的IFN-γ,提示我们GPR116受体可能影响CD8~+T细胞的细胞毒性功能。因此我们构建了鼠源的NKG2D-CAR,通过制备野生型和Gpr116敲除型的mNKG2D-CAR T细胞,比较GPR116是否影响CAR T细胞的细胞毒性功能。结果表明,Gpr116敲除的mNKG2D-CAR T细胞杀伤小鼠前列腺癌细胞的效果更强,表达更高水平的激活分子CD25和CD107a,分泌更多的IFN-γ和颗粒酶B。另外我们还发现Gpr116敲除后能显著促进mNKG2D-CAR T细胞的增殖,且体内的抗肿瘤效果也更明显。随后为了进一步验证GPR116对NKG2D-CAR T细胞抗肿瘤功能的影响,我们通过RNA干扰的方法构建并筛选出GPR116敲低效果最显著的shRNA序列及载体,进一步制备人源的NKG2D-CAR T细胞来检测其抗肿瘤功能。与鼠源CAR T的结果相一致,GPR116下调后能明显增强NKG2D-CAR T细胞对前列腺癌细胞PC-3的杀伤,116shRNA-G2DCAR T细胞的激活分子CD69和CD107a的表达升高,IFN-γ和颗粒酶B的分泌增加,增殖和抗凋亡功能增强,并且体内的抗肿瘤效果明显更强。以上结果表明GPR116是一种负调控蛋白,其下调后能够增强NKG2D-CAR T细胞的杀伤、增殖和抗凋亡等功能,从而增强NKG2D-CAR T细胞的抗肿瘤效果。我们进一步对其负调控机制进行了探究,Western blot检测发现GPR116受体通过调节Gαq蛋白来抑制下游的PI3K-Akt-NF-κB信号通路,进而影响T细胞的功能。本研究为增强CAR T细胞的抗肿瘤功能寻找到了一个新的靶点和方向,也为提高实体瘤治疗以及药物靶点开发提供了新的理论依据。