大环内酯Macrolactin高产菌株的诱变选育及对草莓灰葡萄孢菌的抑制作用

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由灰葡萄孢菌引起的灰霉病是一种对草莓极具破坏力的病害,其感染机制复杂、寄生范围广、易发生遗传变异。因此,寻找一种高效环保、不易产生抗药性的抑菌物质对指导草莓采后灰霉病的防治具有重要意义。本文中Macrolactin类大环内酯为暹罗芽孢杆菌的次级代谢产物,已有基础研究表明其对灰葡萄孢等植物病原菌抑菌作用明显,本文在此基础上对Macrolactin进行分离纯化及结构鉴定,并进一步研究其对草莓灰葡萄孢菌的防治作用。但野生菌发酵产生的大环内酯Macrolactin产量较低,相关的调控机制尚不明确,限制了该类化合物的研究与应用,所以,本研究采用人工诱变育种手段以提高大环内酯Macrolactin的产量并且通过蛋白质组学分析大环内酯Macrolactin合成相关的调控机制。主要研究结果如下:(1)采用硅胶柱层析、TLC、Semi-HPLC等纯化手段对B.siamensis YB304发酵产物中的大环内酯Macrolactin进行分离纯化,经LC-MS、13C-NMR、1H-NMR谱图鉴定,确定化合物NJ08-3为24元大环内酯Macrolactin R,结构式为C30H44O10。该化合物的抑菌活性在p H5-7、低于80℃下可保持较长时间稳定,对大部分常规有机试剂不敏感。同时,大环内酯Macrolactin R对部分细菌和真菌均具有良好的拮抗作用。(2)采用UV-ARTP复合诱变,结合抑菌圈活性初筛及HPLC复筛,得到一株突变菌株Mut-K53,其发酵性能相比之野生菌株得到显著提高,Macrolactin R产量提高3.95倍,即156.5μg/m L,且具有遗传稳定性。(3)采用TMT蛋白质组学结合PRM验证技术,分析差异蛋白引起的大环内酯Macrolactin代谢通路变化及相关调控机制。结果表明:突变菌株Mut-K53对蔗糖等碳源的利用加强;糖酵解途径积极上调;芳香族氨基酸等氨基酸代谢途径显著上调,产生的各种酰基辅酶A和氨基酸等前体物质是Macrolactin产量提高的主要原因之一。同时,大环内酯Macrolactin合成代谢的关键蛋白多为上调蛋白,这是导致Macrolactin R产量增加的直接原因。(4)通过Macrolactin R对草莓灰葡萄孢的抑菌活性研究,结果表明Macrolactin R对草莓灰葡萄孢菌丝的EC50值为2.88μg/m L,对孢子的EC50值为1.93μg/m L,其抑菌效果与纳他霉素、嘧霉胺等杀菌剂相当;且Macrolactin R对草莓感染灰霉病的防治效果显著;可通过破坏灰葡萄孢细胞膜结构造成细胞凋亡及内容物渗漏。综上,Macrolactin R对草莓灰葡萄孢菌具有良好的抑制作用。
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