[研究背景]结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,根据世界卫生组织wHO的GLOBOCAN2008数据显示,结直肠癌已经成为世界上第四大常见肿瘤。2008年的新发病例大约有一百二十万,死亡病例有六十万。在中国,根据GLOBOCAN2008的数据显示,结直肠癌在男性和女性中均为第五大常见肿瘤,死亡率也在所有恶性肿瘤中排第五位。尽管对于结直肠癌的治疗已经有了很大的进步,放射治疗和化学治疗也越来越普遍,但是对于发生了局部浸润和转移的患者治疗疗效仍然不乐观,发生转移的患者的五年生存率要低于10%。因此,进一步发现结直肠癌的治疗靶点以及阐明其机制对于提高结直肠癌患者的生存率,改善结直肠癌的治疗效果将具有非常重要的意义。钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMKs)是一类具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的激酶家族,其通过钙离子信号通路来调节多种细胞的生存与活性。钙离子与广泛表达的钙调蛋白相结合,使其发生构象改变,促进钙调蛋白与不同的CaMKs结合,从而能使CaMKs发生构象改变,导致酶的活化。CaMKs包括CaMKI, II, IV和K,其中研究的最多的是CaMKII, CaMKII又包括CaMKII α, β,γ和6四种亚型。研究表明CaMKII与多种恶性肿瘤如白血病、骨肉瘤等的发生有着密切的关系,然而其与结直肠癌的关系尚未有文献报道。本实验对CaMKII γ促结直肠癌增殖的作用进行了较系统的体内和体外研究,体外研究发现CaMKII γ可以促进结直肠癌细胞的细胞生长与克隆形成,荷瘤裸鼠实验也证实CaMKII γ有促进结直肠癌细胞在体内增殖的作用。研究发现,CaMKII y促进NFκB通路中的IKK磷酸化,IKK激活后可以磷酸化IκB从而促使IκB降解,使其与NF κ B P65分离,P65进核增加,从而促进细胞增殖。总之,本研究证实,结直肠癌细胞中存在着CaMKII γ的高活化状态,而CaMKII γ的高活化可以通过促进NFκB信号通路的激活而促进结直肠癌细胞在体内外的增殖。化学致癌剂和炎症因子可能是通过CaMKII γ而促进NFκB信号通路的激活,因此我们推断,CaMKII γ可能参与了结直肠癌的发生发展过程。[研究目的]研究钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II γ (CaMKII γ)体内外促进结直肠癌细胞增殖的作用,并探讨其机制。[研究方法]1.半定量RT-PCR法测定5种结直肠癌细胞系及20对结直肠癌组织及其配对癌旁组织中CaMKII γ的mRNA表达水平。2.MTT法检测CaMKII的抑制剂KN93对SW480和SW620肠癌细胞增殖的作用3. Western blot检测CaMKII抑制剂KN93对SW620细胞的IKK α、IKKβ、IKK γ、p-IKKα/β、p-IκB和IκB表达水平的影响。4.用慢病毒载体pLenti6.3-MCS-IRES2-eGFP (Invitrogen, USA)制备慢病毒颗粒Lenti-CaMKIIy,转染SW620细胞。5.绘制细胞生长曲线观察CaMKII γ对SW620细胞增殖能力的影响。平板克隆形成试验观察CaMKII γ对SW620细胞克隆形成能力的影响。6. Western blot检测CaMKII γ对SW620细胞的IKK α、IKK β, IKK γ、p-KK α/β、p-I κ B和IκB表达水平的影响。7.免疫荧光检测稳定表达CaMKII y后SW620细胞的NFκB P65核浆及核内的表达情况。8.裸鼠移植瘤试验观察稳定表达CaMKII γ后SW620细胞成瘤能力的改变,及瘤体中IKK α、IKKβ、IKK γ、p-KK α/β、p-IκB和IκB的表达水平。[研究结果]1.以K562作为阳性对照,RKO、HCT-116、SW620细胞系中CaMKII γ的mRNA水平与K562相近,而HT29细胞系中CaMKII y的mRNA水平是K562的1.8倍。20对结直肠癌的癌组织与癌旁组织中,有18对的癌组织中CaMKII y的mRNA水平比在癌旁组织中高(90%),癌组织和癌旁组织中CaMKII y的mRNA表达水平分别是0.67±0.475,0.26±0.305,具有统计学差异(P<0.05)。2.10μ M的KN93处理SW620细胞48h和72h后,KN93处理组细胞减少9.5%和50.2%；作用于SW480细胞48h和72h后,KN93处理组细胞减少24.3%和36.2%。20μ M的KN93处理SW620细胞48h和72h后,KN93处理组细胞减少62.8%和90.1%；作用于SW480细胞48h和72h后,KN93处理组细胞减少34.9%和76.9%。3.PMA与TNFα刺激30min, NFκB通路被激活后加KN93及其阴性对照KN92,作用48h, KKα、IKK β、IKK γ蛋白表达无明显变化,p-IKK α/β、p-I κ B蛋白表达增强,IκB蛋白表达下降。4.用慢病毒载体pLenti6.3-MCS-IRES2-eGFP (Invitrogen, USA)成功制备慢病毒颗粒Lenti-CaMKIIγ,转染SW620细胞后,Western blot检测转染细胞CaMKII γ蛋白及其磷酸化蛋白表达明显增高。5.生长曲线显示SW620-CaMKII y细胞增值能力强于SW620-EGFP细胞,结果从第三天开始有统计学意义(P<0.05)；平板克隆形成试验显示SW620-CaMKII γ细胞的克隆形成率比SW620-EGFP细胞高30.4%,具有统计学差异(P<0.05)。6. SW620-CaMKII γ细胞与SW620-EGFP细胞相比,IKK α、IKKβ、IKKγ蛋白表达无明显变化,p-IKK α/β、p-IκB蛋白表达增强,IκB蛋白表达下降。7.免疫荧光检测显示SW620-CaMKII y细胞与SW620-EGFP细胞相比,NF κ B P65进核增加。8.裸鼠成瘤试验显示,SW620-CaMKII y细胞成瘤后的瘤径在成瘤后第8天和第12天分别为SW620-GFP细胞的1.46倍和1.68倍,具有统计学差异(P<0.05)。 SW620-CaMKII y细胞成瘤的瘤体与SW620-EGFP细胞相比,IKK α、IKK β、 IKKY蛋白表达无明显变化,p-IKK α/β、p-IκB蛋白表达增强,IκB蛋白表达下降。[结论]1.人结直肠癌细胞系和组织中CaMKII y在mRNA水平较高。但是细胞株不同,其表达水平不同。2.CaMKII γ可以促进结直肠癌细胞系的体外生长与克隆形成能力。3.CaMKII γ可以促进结直肠癌细胞系在裸鼠体内的成瘤能力。4.CaMKII γ能够激活结直肠细胞系中的NFκB通路,促使NFκB P65进核,从而促进细胞增殖。