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目的:脊髓缺血再灌注损伤（spinal cord ischemia/reperfusion injury,SCII）会引发脊柱或胸腹动脉瘤等手术后的一系列并发症,造成患者截瘫甚至威胁其生命。脊髓缺血再灌注损伤的机制十分复杂,包括兴奋性氨基酸的释放、炎症反应和神经元凋亡等,但现有的研究缺乏对机制的全面了解,导致临床的有效治疗和防护措施十分有限。激活蛋白1（activator protein-1,AP-1）是由Jun（c-Jun,Jun B和Jun D）和Fos（c-Fos,Fra B,Fra-1和Fra-2）家族蛋白组成。Fra-1和c-Fos是Fos家族的成员之一,c-Fos在脊髓缺血再灌注损伤中表达增加,被认为是神经元激活的标志。AP-1家族的成员与调控细胞因子的表达和细胞凋亡有关。S100A8蛋白是TLR4的配体,被作为心肌缺血的重要治疗靶点。然而,Fra-1和S100A8在脊髓缺血再灌注损伤中的作用和影响尚不清楚。此外,Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）抑制剂,TAK-242可以抑制TLR4下游通路,但是否在脊髓缺血再灌注损伤中抑制S100A8/TLR4通路的激活并减少细胞凋亡和炎症反应需要进一步的研究证明。Micro RNA（miRNA）在脊髓缺血再灌注损伤中发挥一定的作用,但miRNAs与Fra-1之间的关系还尚未有研究。因此,我们想通过研究Fra-1,S100A8及TLR4通路和miRNAs,了解脊髓缺血再灌注的损伤机制,为临床治疗提供新思路。研究方法:1、通过夹闭SD大鼠主动脉弓14分钟,建立SCII模型,随机分为假手术组（sham组）和脊髓缺血再灌注组（I/R组）。选取大鼠脊髓缺血再灌注后6h、12h、24h、36h、48h、72h的时间点,对大鼠L4-L6段脊髓进行取材。通过蛋白质印迹法（Western blot,WB）和聚合酶连锁反应定量反转录实验（Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测不同时间点Fra-1的蛋白和RNA的表达水平,WB实验检测不同时间点的cleaved caspase-3、S100A8的蛋白水平。采用免疫荧光染色法定量检测分析Fra-1的细胞定位,分析Fra-1在sham组与I/R组的表达差异,用Neun（神经元的标志物）、Iba-1（小胶质细胞标志物）和GFAP（星形胶质细胞标志物）标记不同的细胞类型。2、建立细胞氧糖剥夺复氧（oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）模型,随机分为control组与OGD/R组,通过CCK-8试剂检测吸光度值,分析OGD/R组细胞发生氧糖剥夺后的0.5h、1h、2h、4h、6h、8h的细胞活性,细胞氧糖剥夺复氧后的12h,24h,36h的细胞活性。利用小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）和载体介导的过表达（Vector-Mediated overexpression,OE）在细胞内干扰Fra-1的表达,干扰效果用WB检测,细胞分为以下几组:正常组（control组）、氧糖剥夺复氧组（OGD/R组）、si RNA干扰Fra-1组（si-Fra-1组）、过表达干扰Fra-1组（OE-Fra-1组）、阴性对照组（NC-Fra-1组）,应用WB检测cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2在不同组的蛋白表达量,以此检测细胞凋亡。采用免疫荧光染色法定量检测control组、OGD/R组、OGD/R+NC组、OGD/R+si-Fra-1组,不同组间细胞中cleaved caspase-3和Fra-1的蛋白表达水平。采用染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）分析Fra-1与S100A8之间是否存在靶向结合的关系。3、通过夹闭主动脉弓14分钟建立大鼠SCII模型。用腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）介导的短发夹状RNA（short hairpin RNA,sh RNA）靶向Fra-1和S100A8基因,然后对大鼠进行鞘内注射。将大鼠分为假手术组（sham组）、脊髓缺血再灌注损伤组（I/R组）、腺相关病毒介导的sh-Fra-1组（I/R+AAV-sh-Fra-1组）、腺相关病毒介导的sh-S100A8组（I/R+AAV-sh-S100A8）以及对应的阴性对照组（NC组）。应用苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）分析完整神经元数目。应用足迹分析评估大鼠不同组间的神经运动功能。应用S100A8重组蛋白（Recombinant protein S100A8,r S100A8）上调S100A8的表达量,使用TLR4受体抑制剂（TAK-242）抑制TLR4下游通路的激活。对大鼠鞘内注射r S100A8,腹腔注射TAK-242,将大鼠分为sham组、I/R组、sham+r S100A8组、I/R+r S100A8+TAK-242组。应用Western blotting检测不同组间的cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、TLR4、核转录因子（nuclear transcription factor-κB,NF-κB）、磷酸化的核转录因子（phosphorylated NF-κB,p-NF-κB）、细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2）、磷酸化的细胞外调节蛋白激酶1/2（phosphorylated ERK1/2,pERK1/2）、白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）的蛋白表达情况。采用原位末端标记法（Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL）检测不同组间细胞凋亡的情况。4、通过夹闭主动脉弓14分钟建立大鼠SCII模型。用miR-29a-mimic、miR-29ainhibitor以及对应的NC质粒对大鼠进行鞘内注射。将大鼠分为假手术组（sham组）、脊髓缺血再灌注损伤组（I/R组）、过表达miR-29a组（I/R+mimic组）、敲减miR-29a组（I/R+inhibitor组）以及对应的阴性对照组（I/R+mimic-NC组和I/R+inhibitor-NC组）。应用双荧光素酶报告基因（dual-luciferase reporter assay）分析Fra-1和miR-29a的靶向结合关系以及结合位点。应用Tarlov评分评估大鼠在不同组间的神经运动功能。应用PCR实验检测不同组间的Fra-1和miR-29a的表达情况。应用WB实验检测不同组间的Fra-1的蛋白表达情况。结果:1、大鼠脊髓缺血再灌注损伤后,Fra-1的m RNA和蛋白水平明显上升,并在再灌注48h后达到最高值。WB结果显示cleaved caspase-3、S100A8在SCII后显著升高,S100A8与Fra-1呈现相关性（r=0.78,P﹤0.0001）。再灌注后的48 h,免疫荧光结果显示神经元和小胶质细胞中Fra-1表达增加,特别是在神经元中,Fra-1表达量最高。鞘内注射AAV-sh-Fra-1后,WB结果显示,与I/R组相比,发现I/R+sh-Fra-1组的Fra-1、cleaved caspase-3、Bax的表达显著降低,Bcl-2的表达显著升高。HE染色结果显示,与sham组相比,I/R组的完整的神经元数目显著减少;与I/R组相比,I/R+sh-Fra-1组的完整神经元数目显著增多。大鼠足迹分析评估结果显示,与sham组相比,I/R组大鼠后肢不能站立,主要靠前肢行走,步长明显减少,Tarlov评分明显降低;与I/R组相比,I/R+sh-Fra-1组大鼠后肢运动功能得到改善,步长明显增加,Tarlov评分明显增加。2、VSC4.1细胞发生氧糖剥夺复氧后,WB结果表明,与control组相比,OGD/R组的cleaved caspase-3、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达下降。应用si-Fra-1转染细胞,对Fra-1的表达进行敲减,与OGD/R组相比,OGD/R+si-Fra-1组的Fra-1、cleaved caspase-3、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高。使用OE-Fra-1对Fra-1进行过表达,与OGD/R组相比,OGD/R+OE-Fra-1组的Fra-1、cleaved caspase-3、Bax表达显著上升,Bcl-2表达则显著降低。免疫荧光染色结果显示,与control组相比,OGD/R组的Fra-1与cleaved caspase-3的表达明显上升;与OGD/R组相比,OGD/R+si-Fra-1组的Fra-1和cleaved caspase-3表达水平显著降低。Ch IP-qPCR结果显示,诱导细胞发生OGD/R后,发现Fra-1与S100A8的启动子区域结合。对大鼠鞘注AAV-sh-Fra-1,q RT-PCR结果显示,与I/R组相比,I/R+sh-Fra-1组的S100A8的m RNA水平显著降低;WB结果显示,与I/R组相比,I/R+sh-Fra-1组的S100A8的蛋白水平显著降低。Tarlov评分结果表明,与I/R组相比,鞘注sh-S100A8后的大鼠Tarlov评分明显增加,运动功能改善。因此,进一步证明在脊髓缺血再灌注损伤后,Fra-1与S100A8启动子结合,促进S100A8的转录表达。3、WB结果表明,大鼠鞘内注射r S100A8,与sham组相比,sham+r S100A8组的cleaved caspase-3、TLR4、p-ERK1/2/ERK1/2、p-NF-κB/NF-κB、IL-1β、Fra-1的表达明显升高;与I/R+sh-Fra-1组相比,I/R+sh-Fra-1+r S100A8组的cleaved caspase-3、TLR4、p-ERK1/2/ERK1/2、p-NF-κB/NF-κB、IL-1β的表达明显升高。大鼠腹腔内注射TAK-242后,WB结果表明,与I/R组相比,I/R+r S100A8+TAK-242组的pERK1/2/ERK1/2、p-NF-κB/NF-κB、IL-1β、Fra-1的表达明显降低。TUNEL的结果表明,与sham相比,sham+r S100A8的细胞凋亡增加;与I/R组相比,I/R+r S100A8+TAK-242组的细胞凋亡减少。Tarlov评分结果表明,与I/R组相比,I/R+r S100A8+TAK-242组的大鼠Tarlov评分明显增加,运动功能改善。4、PCR结果表明,大鼠SCII后,与sham组相比,miR-29a在再灌注的12小时、24小时、48小时的表达明显降低。大鼠鞘内注射miR-29a-mimic后,与I/R组相比,I/R+mimic组的miR-29a-3p的表达明显升高,且Fra-1的m RNA和蛋白以及S100A8的蛋白表达明显降低。Tarlov评分结果表明,与I/R组相比,I/R+mimic组的大鼠Tarlov评分明显增加。结论:大鼠脊髓缺血再灌注损伤后,下调Fra-1的表达可以减少细胞凋亡和脊髓炎症,改善运动功能,因此减轻大鼠的脊髓缺血再灌注的损伤。S100A8是Fra-1的直接靶点,SCII发生后,S100A8水平升高引起TLR4、p-NF-κB/NF-κB、pERK/ERK表达上调,IL-1β表达增加。这些S100A8诱导的改变被腹腔注射的TAK-242抑制。TAK-242还抑制了ERK和NF-κB通路的激活,从而降低了Fra-1的表达。miR-29a可以靶向结合Fra-1,调控Fra-1和S100A8的表达。Fra-1靶向的S100A8也表现为Fra-1的上游,在SCII激活的信号通路中,Fra-1/S100A8相互作用形成一个反馈回路。