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急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是临床急危重症,病因复杂,病情发展迅速,具有较高死亡率。ARDS的机制涉及炎症反应、氧化应激、水通道蛋白的形成和细胞凋亡等多方面;其中氧化应激和炎症反应对ARDS发展及转归起主要作用。线粒体是活性氧产生的主要场所,与炎症反应密切相关,线粒体融合和分裂运动是维持线粒体功能的重要调节因素,氧化应激损伤可导致线粒体融合减少、分裂增多[1-2]。研究发现,一氧化碳(Carbon Monoxide,CO)是血红素氧化酶-1(heme o xygenase-1,HO-1)降解血红素的产物,具有抗炎抗氧化应激的作用,HO-1/C O可对ARDS有保护作用[3]。本课题组前期研究是从线粒体动力学角度阐释C O对ARDS的保护机制,即CO减少内毒素所致肺泡巨噬细胞的凋亡,减轻氧化应激和炎症反应,并促进肺泡巨噬细胞线粒体融合蛋白-1(MFN1)的表达,降低分裂蛋白FIS1的表达[4-5]。1-磷酯酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(P I3K/Akt)信号通路广泛存在于各种细胞中,调控细胞生长与存活、增殖、凋亡、糖类代谢、基因转录、细胞迁移运动和细胞周期等多种细胞活动[6-7]。研究表明,PI3K/Akt通路可以提高HO-1的表达对脓毒症所致ARDS具有保护作用[8-10]。本研究拟通过建立大鼠内毒素攻击肺泡巨噬细胞模型,给予CO释放剂CORM-2和PI3K/Akt通路阻断剂LY294002,探讨内毒素攻击大鼠肺泡巨噬细胞时,PI3K/Akt信号通路在CO对MFN1和FIS1表达中的作用。目的评价PI3K/Akt通路在CO对内毒素攻击大鼠肺泡巨噬细胞线粒体MFN1和FIS1表达中的作用。方法传代培养12~20周龄大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383,以密度4×104个/ml接种于96孔板,培养24 h后,采用随机数字法分为10组(n=10):对照组(C组)、内毒素组(L组)、内毒素+一氧化碳释放剂组(L+O组)、内毒素+一氧化碳释放剂+阻断剂组(L+O+Y组)、内毒素+DMSO组(L+D组)、内毒素+iCORM-2组(L+iC组)、内毒素+阻断剂组(L+Y组)、一氧化碳释放剂组(O组)、阻断剂组(Y组)、一氧化碳释放剂+阻断剂组(O+Y组)。L组、L+O组、L+O+Y组、L+D组、L+iC组、L+Y组均给予10μg/ml LPS处理大鼠肺泡巨噬细胞NR8383,制备内毒素攻击模型;L+O组于LPS处理前1 h给予CORM-2 100μmol;L+D组、L+iC组于LPS处理前1 h分别给予DMSO和iCORM-2 100μmol。L+O+Y组分别于LPS处理前1.5、1.0 h给予抑制剂LY294002 20μg、CORM-2100μmol;L+Y组于LPS处理前1.5 h给予LY294002 20μg。O组给予CORM-2 100μmol,Y组给予抑制剂LY294002 20μg,O+Y组前后相差0.5h给予抑制剂LY294002 20μg、CORM-2 100μmol。C组正常培养,加入等量PBS溶液作空白对照组。每组细胞处理完毕后继续孵育24 h再收集各组细胞样本。采用ELISA法测定细胞上清液TNF-α和IL-10的含量,按照相应的试剂盒上的指示测定细胞中ROS、MDA含量和SOD、ATP酶活力;采用RT-PCR和Western blot法测定细胞中MFN1、FIS1、HO-1、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)的表达。结果与L组相比,C组和L+O组IL-10含量、ATP酶活力和SOD活性增高,MDA、ROS和TNF-α含量减少;L+Y组SOD活性下降,IL-10含量减少,MDA、ROS和TNF-α含量增加(P<0.05)。与L+O+Y组相比,L+O组和O+Y组IL-10含量增加,SOD活性增高,MDA、ROS和TNF-α含量减少;L+Y组MDA、ROS和TNF-α含量增高,SOD活性下降,ATP酶活力和IL-10下降(P<0.05)。与L+O组相比,L+iC组IL-10含量减少,SOD活性下降,TNF-α和MDA含量增高;O组IL-10含量增多,SOD活性增高,MDA含量减少(P<0.05)。与L组相比,C组HO-1表达及mRNA水平下降,MFN1表达及mRNA水平升高,FIS1表达及mRNA水平下降;L+O组HO-1和MFN1表达及mRNA升高,FIS1表达及mRNA下降,Akt、p-Akt的表达增多;与L+O+Y组相比,L+O组HO-1和MFN1表达及mRNA水平上升,Akt、p-Akt的表达增多,FIS1表达及mRNA水平下降;L+Y组HO-1和MFN1表达及mRNA水平下降,FIS1表达及mRNA水平下降,Akt表达减少(P<0.05)。与L+O组相比,L+iC组HO-1和MFN1表达及mRNA水平下降,FIS1表达及mRNA水平升高,Akt表达减少(P<0.05);与L+Y组相比,L+D组HO-1和MFN1表达及mRNA水平上升,FIS1表达及mRNA水平下降,Akt表达增多(P<0.05)。结论CO促进大鼠肺泡巨噬细胞内毒素损伤时线粒体MFN1的表达,抑制FIS1的表达,而PI3K/Akt信号通路是其机制之一。