研究目的通过体外实验,研究益肾骨康方对肺癌细胞增殖和转移的干预作用及机制,为进一步研究益肾骨康方抗肿瘤作用提供实验依据。研究方法实验一益肾骨康方对肺癌A549细胞增殖的影响:取肺癌A549细胞,接种于96孔培养板中。分别加入不同梯度浓度的益肾骨康方。在培养24、48、72小时后,利用cck-8法检测吸光度值,计算得到细胞存活率,筛选出合适的益肾骨康方低剂量组和高剂量组干预浓度。实验二益肾骨康方对肺癌A549细胞迁移的影响:取肺癌A549细胞,接种于6孔培养板中,待细胞长满后,用枪头划3道划痕。分4组干预:对照组、益肾骨康方低剂量组、益肾骨康方高剂量组、环磷酰胺组,于0、24、48小时倒置光学显微镜下拍照记录划痕的宽度,计算得到划痕愈合率。实验三益肾骨康方对肺癌A549细胞黏附的影响:将Matrigel基质胶铺于96孔培养板,分别将干预后的4组细胞（对照组、益肾骨康方低剂量组、益肾骨康方高剂量组、环磷酰胺组）接种于培养板中,1小时后,吸去未黏附的细胞,CCK-8法检测吸光度值,计算得到细胞黏附率。实验四益肾骨康方对肺癌A549细胞侵袭的影响:Transwell小室的上室铺入Matigel基质胶。分别将干预后的4组细胞（对照组、益肾骨康方低剂量组、益肾骨康方高剂量组、环磷酰胺组）接种于上室,下室加入培养基。24小时后,拭去上室中基质胶,固定,染色,拍照并计数下室的细胞数。实验五益肾骨康方对肺癌A549细胞表面形态的影响:将A549细胞接种于96孔培养板中的细胞爬片上,分2组（对照组和益肾骨康方组）干预24小时,固定,脱水,干燥,喷金,扫描电镜观察、拍照。实验六益肾骨康方对肺癌A549细胞转录组的影响:实验分2组（对照组和益肾骨康方组）干预24小时,利用转录组基因测序技术,得到中药干预后差异表达基因,并通过G0（基因本体）和KEGG（京都基因与基因组百科全书）对差异表达基因进行功能富集分析。利用Cytoscape3.6.0软件构建差异表达基因蛋白互作网络,找出与肿瘤转移相关的关键基因。研究结果实验一:从益肾骨康方干预浓度范围在1 mg/ml至8mg/ml时,生药浓度越高及作用时间越长,A549细胞增殖受抑制的程度越明显。在24小时其最佳半数抑制浓度为4.18 mg/ml。为进一步观察益肾骨康方对肺癌细胞迁移、侵袭、黏附的影响,后续实验采用1 mg/ml和4.18 mg/ml浓度的益肾骨康方进行干预,分别设为益肾骨康方低剂量组和益肾骨康方高剂量组。实验二:24、48小时与对照组比较,益肾骨康方低、高剂量组和环磷酰胺组细胞迁移率均明显降低（P<0.01）,且益肾骨康方高剂量组迁移率低于益肾骨康方低剂量组（24小时:P<0.05;48小时:P<0.01）,而环磷酰胺组细胞迁移率低于益肾骨康方低、高剂量组（P<0.01）。实验三:与对照组比较,益肾骨康方高剂量组和环磷酰胺组均明显抑制了肺癌A549细胞与基质胶之间的黏附能力,抑制率分别为64.15%（P<0.01）、36.56%（P<0.01）。与益肾骨康方低剂量组和环磷酰胺组相比较,益肾骨康方高剂量组的细胞黏附率降低（P<0.01）。实验四:与对照组比较,益肾骨康方低剂量组、益肾骨康方高剂量组和环磷酰胺组穿过基质胶及膜的细胞数目均明显减少（P<0.01）,但益肾骨康方低、高剂量组及环磷酰胺组间比较,发生侵袭的细胞数目间差异无统计学意义。实验五:扫描电镜结果显示对照组细胞形态正常,饱满,表面有膜皱,丝状伪足。益肾骨康方组可见细胞表面膜皱显著减少,丝状伪足断裂,凋亡小体形成。实验六:差异基因筛选|log2FoldChange|>1的差异表达基因有440个,包括下调基因有136个,上调基因有304个。其中与癌症密切相关的基因为SOX2,在给药组中表达下调。在G0功能富集过程中共得到307条结果,主要涉及生物过程（237项）、细胞组分（56项）和分子功能（14项）与中药抑制肺癌作用机制相关的差异表达基因的功能富集结果显示,在生物过程中,主要包括外源性凋亡信号通路、转移酶活性的负调节等;在细胞组分中,主要包括黏着连接、细胞-基质连接、细胞-基质黏附连接等;在分子功能中,主要包括细胞黏附分子结合、钙黏蛋白结合参与细胞黏附、细胞-细胞黏附介质活性等。KEGG通路分析,结果显示与益肾骨康方抑制肺癌A549细胞的作用相关机制主要涉及到细胞凋亡方面。通过构建蛋白互作网络,找到与中药干预肺癌增殖和转移相关2个节点度较高的基因:MMP9和CCL2。与对照组比较益肾骨康方下调了 MMP9和CCL2基因的表达。研究结论1、益肾骨康方可能通过降低肺癌A549细胞的增殖、迁移、侵袭、黏附力,并促进肿瘤细胞凋亡,从而抑制肺癌细胞的生长活性和转移活性。2、益肾骨康方抑制肺癌A549细胞转移能力的机制可能与下调SOX2、MMP9和CCL2基因的表达有关。