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第一部分AAED1在胃癌细胞中的表达及其功能目的:抗氧化酶包含区域1(AAED1),转录的蛋白在脑组织中多个区域被发现,在神经性疾病中被发现有调控作用。AAED1含有抗氧化酶片段的结构,表明其在抗氧化反应中有重要的调控作用,抗氧化反应在恶性肿瘤的特征性代谢过程中有重要影响,推测AAED1可能在恶性肿瘤代谢调控中起作用。本部分研究基于此观点,检测AAED1在胃癌组织和正常胃粘膜的表达差异以及敲减AAED1基因后胃癌细胞表型的变化。体内试验观察敲减AAED1后对胃癌细胞在小鼠体内成瘤的影响。期望本研究能够发现AAED1在胃癌细胞的分子生物学功能。方法:使用免疫组化染色的方法检测临床的胃癌根治术后石蜡组织标本中AAED1在胃癌组织和正常组织的表达差异。通过q RT-PCR和Western Blot实验筛选慢病毒转染的敲减AAED1后的稳转细胞株,敲减后AAED1下降明显的AGS和MGC-803两株细胞,作为实验的细胞株,建立AAED1稳定敲减的细胞系。CCK8实验检测AAED1敲减对胃癌细胞的增殖活力的影响;划痕实验检测AAED1敲减对胃癌细胞体外迁移能力的影响;Transwell细胞侵袭实验检测AAED1敲减对胃癌细胞侵袭能力的影响;克隆形成实验检测AAED1敲减对于胃癌细胞克隆形成能力的影响;裸鼠体内的成瘤实验检测AAED1敲减对胃癌细胞动物体内的成瘤能力的影响。结果:免疫组化染色显示AAED1在胃癌组织和正常组织表达有明显差异,AAED1在胃癌组织比癌旁正常粘膜中表达高(p<0.01)。体外实验证实AAED1敲减后抑制胃癌细胞的体外细胞增殖活性、迁移能力、侵袭能力,克隆形成能力。体内实验证实AAED1敲减后抑制胃癌细胞的体内成瘤能力。结论:AAED1在胃癌组织中高表达。AAED1对于胃癌细胞体外细胞增殖活性、迁移能力、侵袭能力,克隆形成能力和体内成瘤能力有重要调控作用。第二部分TCF7L1在胃癌细胞中的表达及其功能目的:TCF7L1属于LEF/TCF(lymphoid enhancer factor/T cell factor)转录因子家族。LEF/TCF转录因子能够在细胞核内与β-catenin结合,并传递Wnt信号来启动相关靶基因。Wnt/?-catenin信号通路在胃癌的调控作用也有报道。Wnt激活因子的功能增强,例如Wnt-1,Wnt-2和Wnt-2B都被证实在胃癌中表达增高。肿瘤研究中,TCF7L1在低生存期的肿瘤病例中被发现表达增高。本部分研究基于此观点,检测TCF7L1在胃癌中的表达,且检测TCF7L1对于胃癌细胞的生物学功能的调控作用。方法:采用分析TCGA胃癌的病例,检测TCF7L1在胃癌病例的表达,并分析TCF7L1与胃癌的恶性程度以及预后的相关性。细胞实验部分用慢病毒感染技术,建立稳定敲减TCF7L1的AGS和MGC-803胃癌细胞,通过CCK8、克隆形成实验、Transwell实验,观察TCF7L1的敲减对于胃癌细胞生物学功能的影响。验证TCF7L1在胃癌细胞发展的调控作用。结果:TCGA数据分析显示TCF7L1在胃癌组织高表达,TCF7L1表达水平与胃癌的预后相关,TCF7L1高表达提示胃癌预后差。TCF7L1敲减后抑制胃癌细胞的体外细胞增殖活性、克隆形成能力和迁移侵袭能力。结论:TCF7L1在胃癌组织中高表达。TCF7L1高表达与胃癌的恶性程度和不良预后相关。TCF7L1对于胃癌细胞体外细胞增殖活性、克隆形成能力、迁移侵袭能力有重要调控作用。第三部分AAED1和TCF7L1对胃癌细胞调控的机制研究目的:AAED1和TCF7L1敲减后的胃癌细胞增殖和侵袭能力受到抑制,但AAED1和TCF7L1调控胃癌细胞发展的机制不明。AAED1和TCF7L1都对氧化还原的细胞代谢途径有调控作用。本部分研究探索AAED1和TCF7L1是否通过胃癌细胞的糖酵解及氧化还原反应途径来调控胃癌细胞代谢,分析AAED1和TCF7L1调控胃癌细胞发展的分子机制。方法:用GSH/GSSG和Western Blot检测AAED1敲减后糖酵解以及HIF1α上下游调控糖酵解的因子表达变化,验证AAED1在HIF1α信号通路的调控作用。DCFH-DA实验检测TCF7L1敲减后胃癌细胞内ROS变化。q RT-PCR和Western Blot检测TCF7L1敲减后NRF2,KEAP1和NRF2下游的转录过程变化,验证TCF7L1在NRF2-Keap1信号通路的调控作用。Seahorse XF实验检测AAED1和TCF7L1敲减后OCR和ECAR,明确AAED1和TCF7L1对于胃癌细胞糖酵解的影响。从各自的功能证实AAED1和TCF7L1对于胃癌糖酵解及细胞代谢的调控作用一致性。结果:AAED1敲减抑制胃癌细胞的ERK1/2和AKT1的磷酸化激活,抑制HIF1α及其下游糖酵解调控因子的表达,从而抑制胃癌细胞糖酵解,证实AAED1对于HIF1α信号通路的调控作用。TCF7L1敲减抑制NRF2蛋白水平表达和NRF2下游的转录过程。TCF7L1敲减,促进Keap1表达,TCF7L1能够调控KEAP1的启动子活性。证实TCF7L1对于NRF2-Keap1信号通路调控作用。AAED1和TCF7L1调控胃癌细胞的糖酵解和抗氧化反应的作用方向一致,通过对于胃癌细胞的代谢调控,促进胃癌细胞的进展,是对于胃癌细胞发展正向的调控因子。结论:AAED1和TCF7L1调控胃癌的氧化还原反应,促进胃癌的糖酵解代谢,AAED1调控HIF1α信号通路,正向调控HIF1α以及下游氧化还原相关调控因子转录;TCF7L1调控NRF2-Keap1信号通路,正向调控NRF2及其下游转录过程,负向调控Keap1表达。AAED1和TCF7L1共同调节胃癌细胞代谢作用方向一致,提高胃癌细胞抗氧化应激能力,促进胃癌细胞存活和增殖是调控胃癌细胞发展的内在机制之一。