背景恶性黑色素瘤属于皮肤癌,具有高转移性并难以治愈。手术是早期的黑色素瘤患者的首要治疗方法,大多数到了晚期的患者一般是放化疗和生物靶向治疗,但其预后表现很差。微小核糖核酸（miRNAs）在人类癌症继发性过程中参与调节关键基因的表达并在多种细胞活动中起着重要作用,它可严格控制目标基因的表达并调节细胞的基本功能。前期研究表明,在增殖能力较强的鼠黑色素瘤细胞B16F10中,miR-763的表达水平明显降低,并且应用生物信息学软件预测GRB2可能是其目标基因,提示miR-763可能具有抗肿瘤活性。然而,miR-763发挥作用的具体机制还尚不清楚。GRB2是一种25 KD的接头蛋白,最初发现是参与完成细胞生长、细胞增殖和新陈代谢等基本细胞活动。最近的研究证明GRB2在多种恶性肿瘤中起重要作用,但其在黑色素瘤中的生物学作用尚不明确。因此,我们深入研究鼠miR-763在人黑色素瘤细胞中是否具有肿瘤抑制作用及其发挥作用的具体分子机制,这将有助于为黑色素瘤患者设计和研发新的药物。目的1.探究miR-763对人黑色素瘤细胞的增殖和迁移能力的影响;2.深入探讨miR-763是否靶向人GRB2基因以及发挥抗肿瘤作用的具体分子机制。方法1.miR-763过表达的稳转细胞系的筛选:miR-763过表达与对照组慢病毒感染人黑色素瘤细胞SK-MEL-5和SK-MEL-28,用puromycin筛选稳转细胞系,观察是否有绿色荧光来指示慢病毒感染细胞模型是否构建成功;2.miR-763高表达对黑色素瘤细胞增殖和迁移的影响:用稳转细胞系进行CCK8实验和Transwell小室实验,观察细胞增殖和迁移能力是否有变化;3.检测GRB2是否为miR-763的靶基因:利用双荧光素酶实验和Western blot检测miR-763对GRB2表达的影响;4.miR-763是否靶向GRB2发挥对黑色素瘤的抑制作用:在黑色素瘤细胞SK-MEL-5和SK-MEL-28中将miR-763均过表达,进行CCK8实验和Transwell小室实验,检测miR-763是否通过GRB2发挥对黑色素瘤的抑制作用;5.miR-763在人黑色素瘤细胞中发挥作用的具体机制:用Western blot检测GRB2下游信号分子cyclin D3的蛋白表达水平和p38的磷酸化水平的变化;6.动物实验检测miR-763过表达对体内黑色素瘤生长的影响:构建裸鼠皮下移植瘤模型,观测并记录肿瘤生长情况,并且提取肿瘤组织蛋白进行Western blot实验检测GRB2下游信号分子蛋白的表达水平。结果1.在人黑色素瘤细胞的稳转细胞系中,miR-763过表达组细胞相比于对照组,其增殖和迁移能力减弱,表明miR-763过表达可能抑制人黑色素瘤细胞SK-MEL-5和SK-MEL-28的增殖和迁移能力。2.双荧光素酶实验证明鼠miR-763和GRB2之间存在靶向关系,并且miR-763过表达下调了GRB2的蛋白表达水平。GRB2过表达能够逆转miR-763 mimic诱导的增殖和迁移的抑制,进一步证明GRB2是miR-763的靶基因。3.通过Western blot实验分析发现miR-763过表达下调了GRB2的下游信号分子cyclin D3的蛋白表达水平和p38的磷酸化水平,证明miR-763通过介导p38 MAPK信号通路发挥对黑色素瘤的抑制作用。4.裸鼠体内实验结果显示,miR-763过表达组肿瘤体积和重量均小于对照组,并且肿瘤组织的Western blot实验结果显示,miR-763过表达下调了GRB2下游信号分子cyclin D3的蛋白表达水平和p38的磷酸化水平,证明miR-763过表达抑制裸鼠黑色素瘤的生长。结论本研究发现了鼠miR-763过表达抑制人黑色素瘤细胞的增殖和迁移能力,并进一步证明GRB2是miR-763的靶基因。miR-763发挥抗肿瘤作用可能是通过靶向GRB2调节p38 MAPK信号通路进而抑制人恶性黑色素瘤细胞的增殖和迁移。因此,这些结果可能在黑色素瘤治疗中有助于药物的研发。