癫痫是由多种原因导致的大脑神经元高度同步化异常放电,引起暂时性大脑功能障碍的慢性疾病,是危害我国人民健康的常见病症之一,年发病率为3.59‰～3.79‰。约15%～25%的癫痫患者由于对现有的抗癫痫药物不敏感而发展为难治性癫痫。皮质发育障碍(malformations of cortical development, MCD)是造成难治性癫痫的重要原因之一。新近证据表明,我国接受手术治疗的难治性癫痫患者中,涉及MCD的患者占57.6%;在小于3岁的儿童难治性癫痫患者中,MCD的比例更是高达80%。因此,阐明MCDs发生发展及致痫的分子机制,是提高难治性癫痫临床诊断及疗效的关键。MCD是一组病理学改变相似疾病的总称,在临床实践中可分为较常见的局灶性皮质发育不良(focal cortical dysplasia,FCD ),结节性硬化(tuberous sclerosis complexes,TSC),以及相对少见的无脑回畸形,巨脑畸形,灰质异位等。根据国际抗癫痫联盟(International league against epilepsy, ILAE) 2011 年公布的 FCD 分型标准,可将FCD分为孤立型病灶和联合型病灶。对于孤立型FCD病灶,依据病理变化特点又分为FCD Ⅰ型和FCD Ⅱ型。FCD Ⅰ型典型的病理表现为皮质板层结构紊乱及微柱样结构的出现。FCD Ⅱ型除包含皮质板层结构紊乱,进一步出现异形神经元(DNs)和气球样细胞(BCs),这些异常的细胞统称为异构神经元(MCs)。目前的研究认为,异构神经元可能是胚胎发育过程中端脑室区神经祖细胞的异常迁移,成熟或细胞死亡所致。电生理实验结果提示,异形神经元较正常形态的锥体神经元具有更高的神经兴奋性,可能是病灶内的放电触发器;而气球样细胞并不能产生动作电位,属于放电“沉默”细胞。总之,目前对于异构神经元的发生及其在MCD的具体作用机制仍有待阐明。瞬时感受器电位(Transient receptor potential, TRP)通道是位于细胞或亚细胞膜系统的非选择性阳离子通道蛋白超家族,具有显著的门控特性及特殊的内源性激活机制。目前已发现的TRP家族成员包括TRPV,TRPC,TRPM, TRPA,TRPP和TRPML等6个亚型,共28个离子通道。TRPV通道作为TRP家族的重要成员,不仅对辣椒素敏感,还可以被伤害性温度刺激、细胞外渗透压变化以及内源性脂代谢产物激活。既往的研究发现,TRPV4在中枢神经系统中广泛表达,并参与突触可塑性等生理过程。此外,TRPV4在脑缺血,神经性疼痛及癫痫发作等病理过程中亦发挥重要的作用。癫痫发作过程中,花生四烯酸的脂质代谢产物表达增加,这些脂质代谢产物恰是TRPV4的激动剂。更为重要的是,激活的TRPV4可增强神经系统兴奋性活动,扰乱“兴奋-抑制”平衡。本研究的预实验中,我们在FCDs病灶切除标本中检测到TRPV4表达上调,且特征性的分布于FCDs的异构神经元。因此,TRPV4在MCD的具体表达模式及其在MCD病理发生和癫痫发生过程的作用,引起了我们的强烈关注。为阐明TRPV4在MCDs中的作用及其可能的机制。我们拟通过western blot,免疫组织化学和免疫荧光双标技术观察TRPV4在MCD临床标本中的表达分布;然后,通过培养原代大脑皮层神经元,我们进一步证实TRPV4在皮层神经元内介导钙离子内流活动及其调控通路;最后,为了解TRPV4在癫痫发生的作用,我们建立MCD动物模型及匹鲁卡品癫痫模型,通过检测TRPV4在模型中的表达,并利用膜片钳技术研究TRPV4激活对癫痫发作过程中突触传递的影响。通过这些研究,我们得到以下结果:一、TRPV4在FCDs致痫灶中的表达分布1.我们通过western blot分析,从蛋白水平检测到TRPV4在正常大脑皮层内有表达;免疫组化结果表明TRPV4主要分布于神经元、胶质细胞及血管内皮细胞;2. FCD临床手术标本的组织匀浆中,TRPV4蛋白表达水平较正常对照皮层明显增高,且FCDⅡ型较FCDⅠ型表达显著增高,而在FCDⅡa和FCDⅡb皮质致痫灶中表达无明显差异。免疫组化结果提示,TRPV4在FCDⅠ型微柱样结构,FCDⅡ型异构神经元,以及各型的胶质细胞中均有表达。免疫荧光双标结果发现:①TRPV4与神经元标记物NeuN或NF200共表达于微柱样结构、DNs和BCs;②TRPV4与星形细胞标记物GFAP共表达于胶质细胞及部分BCs,而在微柱样结构和DNs未见共表达;③TRPV4与Glutamate, GABA和GAD67等中间神经元标记物在微柱样结构,DNs和BCs均有共表达。以上结果提示TRPV4在FCDs皮质致痫灶中可能发挥重要作用;3.进一步的研究发现,TRPV4上游的调控信号分子PKC和PKA在FCDⅠa,FCDⅡa和FCDⅡb皮质致痫灶中均有表达,但PKA在FCDs中的表达较正常对照皮层无明显差异,而PKC在FCDs中的表达显著上调,提示FCDs皮质致痫灶内可能是通过PKC而非PKA对TRPV4发挥调控作用。二、TRPV4在TSC皮质结节中的表达分布1.本部分研究,我们收集TSC皮质结节及结节周围的手术切除标本,从蛋白水平证实TRPV4在TSC皮质结节中的表达相对于结节周围及正常对照皮质显著增加,提示TRPV4的高表达可能与TSC皮质结节的发生发展有关;2.免疫组化和免疫荧光双标的研究结果显示,TRPV4在TSC皮质结节中的DNs,GCs和星形胶质细胞中有表达,且TRPV4与NF200, Glutamate和GABA共表达于DNs和GCs,未见TRPV4与GFAP共表达于DNs和GCs。3. TRPV4的上游调控信号PKC和PKA在DNs和GCs均有表达,但PKC在TSC结节较结节周围组织和正常对照组织中的表达显著上调,而PKA的表达在TSC及正常对照组织中无明显差异。三、TRPV4对皮层神经元钙离子的调控作用1.我们通过培养原代脑皮层神经元,利用激光共聚焦钙成像技术,结合TRPV4激动剂与抑制剂,在胞内钙离子荧光探针Fluo-3的作用下,研究TRPV4激活对神经元胞内钙离子浓度变化的调控;2.采用4αPDD激活TRPV4后发现,胞内钙离子浓度增加与TRPV4激活程度呈现量效关系,且TRPV4是通过引入胞外钙离子内流而引起胞内钙离子浓度的迅速增高;3.采用PKC和PKA通路激动剂与抑制剂发现,PKC通路是调控TRPV4影响胞内钙离子浓度增高的上游调控分子,而PKA通路则不具有类似效应。四、TRPV4在MCD癫痫发生中的作用1.我们通过腹腔内注射亚甲基偶氮甲醇构建MCD大鼠模型,western blot检测发现TRPV4的表达在MCD模型与正常对照之间无显著差异,这提示TRPV4可能未参与MCD病理发生;2.然后,我们通过匹鲁卡品腹腔注射构建癫痫小鼠模型。Western blot,免疫组化和免疫荧光结果发现,TRPV4在癫痫模型中的表达显著上调,提示TRPV4与癫痫发作存在紧密联系。3.最后,我们利用癫痫小鼠模型脑片进行膜片钳实验。结合TRPV4激动剂4αPPD与抑制剂HC067047,我们发现癫痫小鼠模型中,TRPV4激活后能显著提升兴奋性突触后电流的发放频率,提示TRPV4通过增强兴奋性突触传递推动癫痫的发生发展。综上所述,本研究结果表明:1. TRPV4及其上游信号调控分子PKC在MCD临床标本中表达显著增加,主要分布于反应性胶质细胞及异构神经元;2.大脑皮层神经元可通过TRPV4调节钙离子向细胞内流动,PKC而非PKA是调控这一功能的信号分子;3.与正常对照动物相比,TRPV4在MCD动物模型的表达无明显差异,但是在癫痫动物模型中表达显著上调。激活TRPV4可以增加癫痫动物模型mEPSC和sEPSC的发放频率;4.以上结果有力提示,TRPV4可能参与MCD的癫痫发生过程。