典型儿茶素和茶黄素分离分析及其缓解雌性db/db小鼠代谢综合征的研究

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中国是世界产茶大国,茶叶种类繁多、品种齐全,对我国经济贡献良多。世界范围内,饮茶的习惯历史悠久,流传颇广。越来越多的科学研究表明饮茶能促进健康,饮茶尤其是绿茶和红茶能预防肥胖症,抵抗癌症,改善心血管状态,缓解神经退行性疾病。报道最多的茶叶活性物质分别是绿茶中的儿茶素(以EGCG为主)和红茶中的茶黄素。但是迄今还未有高效制备高纯度茶叶活性物质单体的分离纯化方法为茶叶健康功效分子机制研究提供原料,大多数研究采用绿茶提取物和红茶提取物为研究对象。因此本论文研究了从绿茶中高效制备非酯型儿茶素单体,以及从茶黄素混合物中制备高纯度茶黄素单体TF和EGC的方法,并且建立了我国6大茶类中15种典型活性成分高效UHPLC含量测定方法,以此为基础调查了我国243个茶叶样品中15种特征成分在各类茶叶的分布特点,另外探索了膳食添加0.1%儿茶素混合物与茶黄素混合物对db/db雌性小鼠代谢综合征的缓解作用。具体研究内容如下:(1)绿茶中儿茶索EGCG和ECG含量较高,但非酯型儿茶素如EGC和另外EC分离研究较少,如何高效纯化绿茶中非酯型儿茶素有较大意义。本论文以绿茶为实验原料,经过咖啡因脱除工艺,萃取制备儿茶素提取物(CE)。CE经单宁酶处理制备非酯型儿茶素混合物(NCE),对非酯型儿茶素EGC和EC进行富集化,含量分别达到390 mg/g和170 mg/g。利用高速逆流色谱法,以正已烷/乙酸乙酯/甲醇/水(1:10:1:10,v/v/v/v)为两相体系,采用顺转与反转模式相结合纯化制备儿茶素。在此最优纯化条件下,100 mg CE和100 mg NCE混合物可以纯化制备27.2 mg 98.8%纯度的EGCG,14.1 mg 97.7%纯度的EGC,以及9.3 mg 98.9%纯度的EC和16.6 mg GA。在反转模式下,80 mg CE和80 mg NCE混合物可以纯化获得19.9 mg 95.0%纯度的EGCG,5.8 mg 95.7%纯度的ECG,8.9 mg 96.4%纯度的EC和15.8 mg GA。(2)茶黄素混合物中茶黄素单体含量较少,混合物中残留儿茶素较多,杂质含量较高,如何从中高效分离制备大量高纯度儿茶素和茶黄素单体极具挑战。本论文以茶黄素混合物为原料,经过单宁酶水解处理,脱除咖啡因,萃取后得到茶黄素酶解产物(TBP)。TBP中茶黄素单体TF和EGC的含量提高了约3倍,分别达到323 mg/g和152 mg/g。利用高速逆流色谱法,在反转模式下,以正已烷/乙酸乙酯/甲醇/水(1:8:1:8,v/v/v/v)为两相体系,在最优条件下可单次进样500 mgTBP制备180.8 mg 97.3%纯度的TF,87.5 mg 95.7%纯度的EGC和15.1 mg 96.2%纯度的EC。与高速逆流色谱法相比,制备液相色谱法以55.5%乙腈为洗脱液,最大进样量为120 mg TBP,一次分离过程能制备11.2 mg 94.9%纯度TF和7.7 mg92.7%纯度EGC。单宁酶水解结合高速逆流色谱法制备纯化TF和EGC效率高,优势明显。(3)为了调查我国5大类茶叶资源中15种茶叶特征活性物质含量分布,以0.2%甲酸和乙腈为流动相建立了一套快速、准确的UHPLC方法。本方法能在30分钟的测试时间内较好分离我国6大类茶叶,即非发酵茶如绿茶和白茶、半发酵茶如乌龙茶和黄茶以及全发酵茶如红茶和普洱中15种活性物质含量。结果表明,白茶和绿茶中儿茶素含量变化不大,儿茶素含量与茶树品种和制作工艺密切相关。发酵类茶如黄茶、乌龙茶、红茶和普洱茶,会随着发酵程度的提高,其儿茶素含量逐渐减少,茶黄素含量升高,表明儿茶素在此过程中氧化转化为儿茶素二聚体,茶黄素。样品中咖啡因和可可碱含量比较稳定,与茶树品种关联性小GA含量变化显著,发酵程度越高,GA含量越高。(4)采用上述构建的UHPLC方法测定了5大类茶叶共243个茶叶样品中15种茶叶特征物质的含量。调查结果显示:与其它同样以我国茶叶样品为对象的调查研究相比,绿茶于白茶中主要儿茶素含量差异不大。EGCG、EGC、ECG和EC是白茶绿茶和乌龙茶中含量最高的儿茶素。所有茶叶中咖啡因含量波动不大。茶叶中GA含量在不同茶叶类别中含量差异较大,以发酵茶类红茶中含量较高。与红茶中茶黄素含量比较,乌龙茶中茶黄素含量较低。比较有趣的是,在君山银针黄茶中检测到较高含量的茶黄素,该结果值得进一步大范围内对我过著名黄茶品种进行调查。为了更好区分不同种类的茶叶,通过主成分分析法对样品量较多的4类茶进行分析,结果表明能提取出3个主成分因子,解释所有样品中85%的数据特征。通过制作三维散点图,4大类茶叶样品间能得到很好的区分,并且与实际茶叶特征相符。(5)探讨了绿茶儿茶素与红茶茶黄素缓解db/db雌性小鼠代谢综合征的效果。膳食添加0.1%儿茶素混合物与茶黄素混合物对db/db雌性小鼠体重、饮食量、饮水量影响不大。儿茶素能显著缓解代谢综合征典型特征,即降低血糖、血脂、血清胆固醇,但是对茶黄素功效甚微。儿茶素能提高小鼠胰岛分泌胰岛素的水平,能减缓胰岛素抵抗。初次探索茶黄素在db/db雌性小鼠体内药物代谢途径与分布,在血清、尿液、肝脏等样品中未能检测到茶黄素存在。通过计算粪便中茶黄素回收率发现,近26%的茶黄素能在粪便中检测到。茶黄素在肠道中生物转化成次级代谢产物(茶黄素硫酸酯化,葡萄糖醛酸化,甲基化等)。在脑组织中,未能检测到儿茶素和茶黄素的代谢产物,说明儿茶素与茶黄素可能无法通过血脑屏障而进入中枢神经系统发预防神经退行性疾病的功效。
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