丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)引起的细菌性溃疡病是猕猴桃生产上一种毁灭性细菌性病害,该病害于1980年首次发现在美国加利福尼亚和日本静冈县,随后蔓延至新西兰、意大利、中国等地,此病害的流行给猕猴桃产业的发展造成重大的经济损失。gacA基因是一类广泛存在于革兰氏阴性细菌中的调控因子,调控着细菌的毒性及次生代谢产物。Psa在寄主选择类型及致病流行条件方面与其他丁香假单胞细菌具有很大差异,然而,至今关于gacA基因在猕猴桃溃疡细菌致病中的作用机制尚未见报道。因此本研究根据已知的丁香假单胞番茄致病变种(P.s.pv.tomato)中调控基因gacA的序列,利用生物信息学手段,从猕猴桃溃疡菌的全基因组中克隆出gacA基因的同源基因。然后采用同源重组的方法构建gacA基因的缺失突变体及回复突变体,并对其功能进行初步分析。研究内容如下:1.猕猴桃溃疡病菌gacA基因的克隆及生物信息学分析根据来源于假单胞菌属(Pseudomonas syringae)、芽孢杆菌属(Bacillus Cohn)、黄单胞菌属(Xanthomonas Campestris)、欧文氏菌属(Erwinia amylovora)已报道的gacA基因,利用CLUSTALX软件进行序列分析,分析结果表明假单胞菌属中gacA基因高度同源,相似性达98%。以猕猴桃溃疡病菌野生型菌株AHP-18为供试菌株,根据假单胞菌属中gacA基因的保守序列,设计特异性引物gacA3/gacA4,克隆得到gacA基因,测序验证正确后,在NCBI上对测序结果进行分析。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)对Psa的GacA蛋白序列的进行结构域分析。结果表明,Psa中GacA具有GacA相似蛋白的结构,GacA蛋白的N端具有一个REC结构域,主要作用是接受信号感受蛋白传递来的磷酸基团;C端具有HTH结构,负责多极化以及和启动子DNA结合。2.猕猴桃溃疡病菌gacA基因缺失突变体的构建及筛选采用同源双交换的方法对猕猴桃溃疡病菌的gacA基因进行缺失突变,首先设计特异性引物(gac-1U/gac-1R、gac-2U/gac-2R)扩增出gacA基因的上下游同源臂片段,为了降低筛选突变株的难度,同时引入氯霉素抗性片段然后采用融合PCR技术构建融合片段作为外源目的片段,测序验证正确后,与自杀载体pK18mobsacB相连,构建重组载体pK18gacA。本研究基于三亲结合技术将重组载体转入野生型菌株AHP-18中,经过同源单交换,得到260株gacA基因单交换菌株,从单交换菌株中筛选得到双交换菌株20株,即为gacA基因的缺失突变株。3.ΔgacA功能互补菌株的构建及筛选设计特异性引物对(gac-F/gac-R)从菌株AHP-18扩增出要补入的基因片段,并且在片段两端同时引入合适的酶切位点(PstI/BamHI),将扩增的外源片段及广宿主质粒pLAFR3分别酶切,然后以3:1进行连接,构建互补重组载体,然后基于三亲结合技术将重组载体导入突变株△gacA基因组中,利用四环素抗性筛选得到阳性克隆,然后进行菌落PCR验证,正确的即为互补菌株。4.猕猴桃溃疡病菌gacA基因的功能分析将野生型菌株、突变型菌株及恢复突变株分别接种猕猴桃活体枝条、离体叶片和烟草叶片,研究gacA基因的生物学功能。试验结果表明,gacA基因参与调控了病菌的毒素和胞外酶合成,病菌的游动能力及致病性等,该基因的缺失导致病菌的产phaseotoxion毒素丧失、胞外酶合成和鞭毛游动能力下降以及致病力降低。