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荸荠(Eleocharistuberosa)通常去皮食用,但是去皮之后极易发生黄化,严重影响产品的外观品质。本研究以鲜切荸荠黄化组织表面为材料,建立了可同时测定鲜切荸荠中主要黄化物质——柚皮素和圣草酚高效液相色谱法(HPLC),并对其中的黄化关键酶——查尔酮异构酶(CHI)和类黄酮3’-羟化酶(F3’H)进行分离纯化和性质研究。在此基础上,以柚皮素查尔酮为底物,添加纯化的CHI和F3’H,模拟鲜切荸荠主要黄化物质——柚皮素和圣草酚体外生成途径,对其体内生成途径进行验证,从而进一步阐明鲜切荸荠黄化机制。结果如下:1、采用HPLC法对鲜切荸荠黄化组织中主要黄化物质——柚皮素和圣草酚进行分离测定。研究表明在柱温4℃,流动相0.5%冰醋酸水溶液-乙腈梯度洗脱,流速1 mL/min,进样量10 μL,检测波长280 nm时,柚皮素和圣草酚的分离测定效果良好。建立的HPLC色谱条件简便快捷,结果准确可靠,能排除鲜切荸荠黄化组织中所含其他物质色谱和其他物质产生的干扰。2、通过硫酸铵分部盐析和DE-52离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析,最终从鲜切荸荠黄化组织中分离纯化到CHI纯化酶。其纯化倍数达到12.35,比活力为125 U/mg,回收率为6.86%。该酶相对分子质量约为14.4 kDa,最适反应温度为45 ℃和最适pH为7.5。金属离子Ca2+和Cu2+对CHI活性表现出极显著抑制作用,而Zn2+、Fe2+和Na+却对其具有极强激活作用。CHI活性明显被DTT、TritonX-100和PVP这些化学试剂激活,却极显著被β-巯基乙醇、SDS和吐温80抑制。此外,EDTA、Vc、抗坏血酸钠和柠檬酸对CHI活性几乎没有影响。以柚皮素查尔酮为底物,测定出该酶对底物的米氏常数Km为2.91 mmol/L,最大反应速度Vmax为45.25 U/mL·min。3、通过硫酸铵分部盐析、DEAE-纤维素离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析对鲜切荸荠黄化组织中F3’H酶进行了分离纯化。该酶纯化倍数达到14.01,比活力提高到478.49 U/mg,回收率为6.38%;相对分子质量约为53.09 kDa。最适反应温度为30 ℃,在温度低于40 ℃时较稳定;最适pH为7.5,在pH6.5～8.0范围内最为稳定。以柚皮素为底物,测定出该酶对底物的米氏常数Km为1.08 mmol/L,最大反应速度Vmax为416.67U/mL·min。金属离子Na+对F3’H活性影响较小,当浓度较大时才呈现抑制作用;Ca2+和柠檬酸却具有强烈抑制作用;而Fe2+和Mg2+却表现出强烈激活作用,且Fe2+激活作用明显高于Mg2+;此外,NADPH和Vc也表现出强烈激活作用。4、利用柚皮素查尔酮与纯化的CHI、F3’H体外模拟反应试验进一步验证了鲜切荸荠主要黄化物质——柚皮素和圣草酚的体内生成途径,即柚皮素查尔酮经CHI催化生成柚皮素,然后柚皮素在F3’H的催化作用下生成圣草酚,并通过HPLC-MS分析体外模拟体系和鲜切荸荠中的主要黄化物质并与标准品作了比对,色谱及质谱结果均显示模拟体系中确实存在与鲜切荸荠相同的主要黄化物质——柚皮素和圣草酚,只是其离子碎片的峰强度和主要黄化物质的含量有所不同。