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人源Ⅱ型胶原蛋白是一种大分子蛋白质,由螺旋状的胶原纤维、弹性蛋白和糖蛋白相互交织形成网状结构,具有较强的机械强度。人源Ⅱ型胶原蛋白是透明软骨的主要的组成部分,对于软骨修复非常有效,并且预计可能成为人工软骨材料、人工角膜材料和其他生物医学材料。目前,胶原蛋白的生产主要是从动物组织中提取。动物来源的胶原蛋白的分子量和结构易被破坏,丧失生物活性,且会产生异体排斥反应和存在病毒隐患。化学合成法合成的胶原蛋白缺乏必须的生物活性结构、过程复杂且成本较高。目前,应用基因工程技术表达重组胶原蛋白已经成为研究的热点。重组胶原蛋白不仅具有较好的生物相容性、生物可降解性和促进细胞粘附的特点,还可以促进上皮细胞形成和止血。另外,重组表达的胶原蛋白比起动物来源的胶原蛋白有较强的可加工性、可溶性和排斥反应低、没有隐藏的病毒隐患。所以,利用重组胶原蛋白作为医药填充物或者人工生物材料,并研究扩大表达和优化工艺是未来的发展方向。昆虫杆状病毒表达系统是一种高级的真核表达系统,具有可容纳大分子片段、较低的背景干扰、较强的翻译后加工和修饰能力等优势。AcMNPV和BmNPV作为常用的基因表达系统的载体,已经成功地生产了多种有用蛋白及蛋白复合体。本研究选取人源Ⅱ型胶原蛋白(human typeⅡcollagen,简称ColⅡ)全序列,利用杆状病毒多基因表达系统高效表达目的蛋白。利用含特异性Tn7转座位点的转移载体pFBDM,构建含有His纯化标签的目的基因ColⅡ和单体樱桃红色荧光蛋白(m Cherry)基因的转移载体pFBDM-polh-colⅡ-p10-IM,通过Tn7转座位点转座导入Ac MultiBac和BmMultiBac载体,获得E.coli rSw106-Ac-pFBDM-polh-colⅡ-p10-IM和E.coli rSw106-Bm-pFBDM-polh-colⅡ-p10-IM重组菌株。asd缺失型重组菌株rSw106-inv可表达侵染蛋白,帮助细菌直接感染昆虫细胞产生重组病毒。将E.coli rSw106-A c-pFBDM-polh-colⅡ-p10-IM和E.coli rSw106-Bm-pFBDM-polh-colⅡ-p10-IM重组菌株分别感染Sf9、BmN细胞,3 d后可观察到樱桃红色荧光,获得重组病毒AcMNPV-ColⅡ-IM和Bm NPV-ColⅡ-IM。经SDS-PAGE和Western blot,可检测到300 kDa的蛋白目的条带,证明目的蛋白ColⅡ在Sf9和BmN细胞中得到表达。利用重组病毒AcMNPV-ColⅡ-IM感染Sf9细胞,收集细胞和上清,应用Ni柱亲和层析纯化,150mM咪唑洗脱可获得单一的300 kDa的蛋白目的条带。证明细胞表达目的蛋白ColⅡ纯化条件摸索清楚。利用重组病毒BmNPV-ColⅡ-IM注射5龄起家蚕幼虫,4 d后观察可见蚕体出现明显荧光,取发荧光家蚕的血淋巴细胞进行SDS-PAGE、Western blo t检测,发现有300 kDa的目的蛋白条带。将蚕皮进行处理、纯化,得到的重组蛋白量可高达约1 mg/头。纯化后的蛋白经MTT法进行活性检测,结果证明重组人源Ⅱ型胶原蛋白具有较强的促进细胞黏附能力。并在扫描电镜下进行观察,可见清晰的孔状结构。综上所述,利用杆状病毒多基因表达系统,可在昆虫细胞中较好的表达诸如人源Ⅱ型胶原蛋白这样的大分子且需要生物活性的蛋白质。利用杆状病毒多基因-家蚕表达系统,不仅可以高效表达大量具有生物活性的外源蛋白,还可获得较高的产量。为人源Ⅱ型胶原蛋白在医学、人造生物材料方面的应用带来了广阔的前景。