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背景和目的:在子宫内膜异位症(endometriosis,EMS)的病理机制中,低氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)与 Prohibitin(即 Prohibitin-1,PHB)均可促进子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)的有氧糖酵解。同时,HIF-1的作用研究机制表明,HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成的,低氧环境下HIF-1α不断累积并向核内转移,与HIF-1ββ构成异源二聚体,通过与靶基因启动子序列上的低氧反应元件(Hypoxiaresponse element,HRE)结合,最终导致靶基因转录。生物信息学显示PHB的启动子中也存在4个HRE。因此我们推论,低氧环境下HIF-1α通过作用于PHB启动子的HRE,降调节PHB表达,进而产生EMs的ESCs“有氧糖酵解”效应,最终改变了异位内膜细胞的生物学行为,导致EMs发生发展。本文分析常氧和低氧环境下ESCs中Prohibitin基因的表达,及其对ESCs增殖的作用;克隆PHB基因的启动子并寻找其核心启动区域;观察HIF-1α与PHB的关系,鉴定HIF-1α是否作为PHB基因启动子的关键转录因子,探讨子宫内膜异位症病理机制中HIF-1α通过降调节PHB促进有氧糖酵解的作用。材料和方法:(1)来源于正常人子宫内膜、EMs患者在位子宫内膜及EMs患者巧囊壁的组织,分别在体外常氧和低氧环境中培养子宫内膜基质细胞,BrdU方法及流式细胞技术检测细胞增殖和凋亡,细胞免疫荧光技术和western blot测定PHB的表达。(2)采用PCR方法获取人PHB基因,将其插入到空载pGL3-Basic中,通过测定荧光素酶活性检测PHB启动子的活性,并寻找其核心启动区域。(3)利用RNA干扰、染色质免疫共沉淀(ChIP)等实验鉴定低氧环境下HIF-1 α与PHB间的降调节关系。(4)行点突变技术探索PHB基因启动子区内HIF-1α的结合位点。(5)观察PHB基因的表达变化对宫内膜基质细胞中有氧糖酵解的影响。结果:(1)相比与正常组及异位组,在位组内膜ESCs常氧或者低氧下的细胞增殖能力最高,细胞凋亡率最低。与常氧相比,低氧下在位组细胞增殖能力明显升高。(2)常氧下,在位组细胞中PHB的表达量最高;低氧处理后,各组细胞中PHB的表达均明显降低。(3)PHB一系列截短质粒的荧光素酶活性分析显示:从-1054bp缺失到-654bp,PHB启动子活性明显下降,而从-654bp缺失到-254bp,PHB启动子活性又明显回升。(4)生物信息学分析显示,PHB启动子区域包含4个HIF-1α的结合位点,点突变实验发现后3个结合位点突变后PHB启动子活性明显升高。(5)染色质免疫共沉淀(ChIP)实验及凝胶电泳结果图显示:目的基因HIF-1α在常氧未见条带,在低氧下见一特异性条带。(6)低氧下,干涉各组细胞中HIF-1α的表达后,PHB的表达明显升高;荧光素酶活性分析发现PHB启动子活性亦有明显增强。(7)上调子宫内膜基质细胞中PHB基因的表达,各组细胞中葡萄糖消耗和乳酸生成均明显降低。结论:(1)在EMs患者中,PHB表达降低,可促进ESCs增殖、抑制ESCs凋亡,从而促进EMs的发生发展。(2)人PHB基因的正向调控核心启动子区域位于-1054bp到-654bp处,负向调控核心启动子区域位于-654bp到-254bp处。(3)低氧下,转录因子HIF-1α能够与PHB基因启动子上的HRE结合,负向调控PHB的表达,为EMs的发病机制提供了新的理论依据。(4)PHB可抑制ESCs的有氧糖酵解效应,可能成为EMs生物治疗的新靶点。(5)子宫内膜异位症病理机制中HIF-1α通过降调节PHB促进有氧糖酵解的作用,具体机制仍有待进一步研究。