论文部分内容阅读
目的
1建立不同产地桑枝生品及桑枝不同炮制品的高效液相色谱(HPLC)特征指纹图谱，为桑枝药材的鉴别和质量评价标准的建立提供参考。
2建立同时测定桑枝中12种化学成分含量的超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)方法，为桑枝质量控制标准的建立提供参考依据。
3建立桑枝不同炮制品中主要化学成分的药代动力学研究方法，为深入挖掘桑枝不同炮制方法的药效作用机制提供实验基础。
方法
1建立不同产地桑枝生品及桑枝不同炮制品的HPLC特征指纹图谱分析方法，色谱柱为Poroshell120EC-C18(4.6×100mm，2.7μm，Agilent)；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱；流速为0.8mL·min-1；检查波长为330nm；柱温为26℃；进样量为20μL。拟合成指纹图谱并进行聚类分析。
2建立同时测定桑枝中12种化学成分含量的UPLC-MS法。色谱条件：色谱柱为Poroshell120EC-C18(4.6×100mm，2.7μm，Agilent)；流动相为乙腈-0.1%甲酸水，梯度洗脱；流速为0.4mL·min-1；柱温为25℃；进样量为5μL。质谱条件：电喷雾离子化(ESI)；检测方法为多反映监测(MRM)；喷雾电压为5500V；加热温度为550℃；载气为氮气；流速为120L·min-1。
3建立大鼠含药血清的UPLC-MS分析方法。色谱条件：色谱柱为Poroshell120EC-C18(4.6×100mm，2.7μm，Agilent)；流动相为乙腈-0.1%甲酸水，梯度洗脱；流速为0.4mL·min-1；柱温为25℃；进样量为5μL。质谱条件：电喷雾离子化(ESI)；检测方法为多反映监测(MRM)；喷雾电压为5500V；加热温度为550℃；载气为氮气；流速为120L·min-1。以建立的UPLC-MS分析方法对不同炮制品给药的大鼠血清进行检测，采用DAS2.0软件计算并对比药动学参数的变化。
结果
1通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)，确定了不同产地桑枝的HPLC特征图谱共有模式，标定了12个共有峰，不同产地桑枝的相似度在0.015~0.969之间；确定了桑枝不同炮制品的HPLC特征图谱共有模式，标定了13个共有峰，不同炮制品的相似度在0.631~0.972之间。
2运用UPLC-MS测定不同产地桑枝生品中各化学成分含量，其中桑皮苷A、异槲皮苷、紫云英苷和白藜芦醇在河北桑枝中含量较高；绿原酸和隐绿原酸在广东桑枝中含量较高；芦丁和金丝桃苷在云南桑枝中含量较高；桑辛素在四川桑枝中含量较高；槲皮苷在广西与安徽桑枝中含量几乎一致，东莨菪内酯和1-脱氧野尻霉素(DNJ)在江苏桑枝中含量较高，结果表明，河北桑枝中大多化学成分含量较高，故用河北桑枝为基础进行炮制；桑枝不同炮制品中醋炙后东莨菪内酯的含量有所提高，其余成分在生品中含量较高。
3通过对比不同炮制品中主要化学成分在正常组和模型组的平均血药浓度-时间曲线(C-t曲线)及药动学参数，结果表明不同炮制品中主要化学成分在正常大鼠及糖尿病大鼠体内的药物成分吸收各不相同；如，经新工艺炮制后桑皮苷A在正常组大鼠体内的Cmax升高，而经醋炙和酒炙后Cmax均降低，经醋炙和新工艺炮制后桑皮苷A在正常组大鼠体内的AUC0-t均升高，而经酒炙后AUC0-t降低，经炮制后桑皮苷A在正常组大鼠体内的t1/2均有所延长；经醋炙和新工艺炮制后桑皮苷A在糖尿病模型大鼠体内的Cmax和AUC0-t均升高，而经酒炙后Cmax和AUC0-t均降低，经醋炙和酒炙后桑皮苷A在糖尿病模型大鼠体内的t1/2均缩短，而经新工艺炮制后t1/2无明显变化；与正常组对比，经醋炙后桑皮苷A在模型组大鼠体内的Cmax升高，而生品、酒炙品和新工艺品中的桑皮苷A在糖尿病模型大鼠体内的Cmax均降低，生品和各炮制品中的桑皮苷A在糖尿病模型大鼠体内的AUC0-t均降低，生品、酒炙品和新工艺品中的桑皮苷A在糖尿病模型大鼠体内的t1/2均延长，而在醋炙品中t1/2缩短。
结论
1不同产地桑枝与对照谱图的相似度差异较大，其原因可能与药材的产地密切相关；桑枝不同炮制品相似度差异较小，说明桑枝经炮制后化学成分的种类无较大变化。该方法简便易操作，为桑枝药材的鉴别、合理采收及进一步开发利用提供参考。
2不同产地桑枝生品中化学成分含量相差较大，可能与药材的产地密切相关；不同炮制品中化学成分含量相差较大，其原因可能与不同炮制辅料对各成分的溶出度的影响有关；通过定量实验确定了桑枝的检测指标及检测方法，结果表明该方法具有分析评价能力良好、结果准确等优势，为进一步的药效研究奠定了基础。
3由不同炮制品中各化学成分的平均血药浓度-时间曲线(C-t曲线)及药动学参数结果表明，桑枝的炮制方法及大鼠的病理状态均影响药物成分在机体内的吸收。该方法专属性强、灵敏度高为后续研究桑枝及其有效化学成分的体内药效及其作用机理奠定了基础。
1建立不同产地桑枝生品及桑枝不同炮制品的高效液相色谱(HPLC)特征指纹图谱，为桑枝药材的鉴别和质量评价标准的建立提供参考。
2建立同时测定桑枝中12种化学成分含量的超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)方法，为桑枝质量控制标准的建立提供参考依据。
3建立桑枝不同炮制品中主要化学成分的药代动力学研究方法，为深入挖掘桑枝不同炮制方法的药效作用机制提供实验基础。
方法
1建立不同产地桑枝生品及桑枝不同炮制品的HPLC特征指纹图谱分析方法，色谱柱为Poroshell120EC-C18(4.6×100mm，2.7μm，Agilent)；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱；流速为0.8mL·min-1；检查波长为330nm；柱温为26℃；进样量为20μL。拟合成指纹图谱并进行聚类分析。
2建立同时测定桑枝中12种化学成分含量的UPLC-MS法。色谱条件：色谱柱为Poroshell120EC-C18(4.6×100mm，2.7μm，Agilent)；流动相为乙腈-0.1%甲酸水，梯度洗脱；流速为0.4mL·min-1；柱温为25℃；进样量为5μL。质谱条件：电喷雾离子化(ESI)；检测方法为多反映监测(MRM)；喷雾电压为5500V；加热温度为550℃；载气为氮气；流速为120L·min-1。
3建立大鼠含药血清的UPLC-MS分析方法。色谱条件：色谱柱为Poroshell120EC-C18(4.6×100mm，2.7μm，Agilent)；流动相为乙腈-0.1%甲酸水，梯度洗脱；流速为0.4mL·min-1；柱温为25℃；进样量为5μL。质谱条件：电喷雾离子化(ESI)；检测方法为多反映监测(MRM)；喷雾电压为5500V；加热温度为550℃；载气为氮气；流速为120L·min-1。以建立的UPLC-MS分析方法对不同炮制品给药的大鼠血清进行检测，采用DAS2.0软件计算并对比药动学参数的变化。
结果
1通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)，确定了不同产地桑枝的HPLC特征图谱共有模式，标定了12个共有峰，不同产地桑枝的相似度在0.015~0.969之间；确定了桑枝不同炮制品的HPLC特征图谱共有模式，标定了13个共有峰，不同炮制品的相似度在0.631~0.972之间。
2运用UPLC-MS测定不同产地桑枝生品中各化学成分含量，其中桑皮苷A、异槲皮苷、紫云英苷和白藜芦醇在河北桑枝中含量较高；绿原酸和隐绿原酸在广东桑枝中含量较高；芦丁和金丝桃苷在云南桑枝中含量较高；桑辛素在四川桑枝中含量较高；槲皮苷在广西与安徽桑枝中含量几乎一致，东莨菪内酯和1-脱氧野尻霉素(DNJ)在江苏桑枝中含量较高，结果表明，河北桑枝中大多化学成分含量较高，故用河北桑枝为基础进行炮制；桑枝不同炮制品中醋炙后东莨菪内酯的含量有所提高，其余成分在生品中含量较高。
3通过对比不同炮制品中主要化学成分在正常组和模型组的平均血药浓度-时间曲线(C-t曲线)及药动学参数，结果表明不同炮制品中主要化学成分在正常大鼠及糖尿病大鼠体内的药物成分吸收各不相同；如，经新工艺炮制后桑皮苷A在正常组大鼠体内的Cmax升高，而经醋炙和酒炙后Cmax均降低，经醋炙和新工艺炮制后桑皮苷A在正常组大鼠体内的AUC0-t均升高，而经酒炙后AUC0-t降低，经炮制后桑皮苷A在正常组大鼠体内的t1/2均有所延长；经醋炙和新工艺炮制后桑皮苷A在糖尿病模型大鼠体内的Cmax和AUC0-t均升高，而经酒炙后Cmax和AUC0-t均降低，经醋炙和酒炙后桑皮苷A在糖尿病模型大鼠体内的t1/2均缩短，而经新工艺炮制后t1/2无明显变化；与正常组对比，经醋炙后桑皮苷A在模型组大鼠体内的Cmax升高，而生品、酒炙品和新工艺品中的桑皮苷A在糖尿病模型大鼠体内的Cmax均降低，生品和各炮制品中的桑皮苷A在糖尿病模型大鼠体内的AUC0-t均降低，生品、酒炙品和新工艺品中的桑皮苷A在糖尿病模型大鼠体内的t1/2均延长，而在醋炙品中t1/2缩短。
结论
1不同产地桑枝与对照谱图的相似度差异较大，其原因可能与药材的产地密切相关；桑枝不同炮制品相似度差异较小，说明桑枝经炮制后化学成分的种类无较大变化。该方法简便易操作，为桑枝药材的鉴别、合理采收及进一步开发利用提供参考。
2不同产地桑枝生品中化学成分含量相差较大，可能与药材的产地密切相关；不同炮制品中化学成分含量相差较大，其原因可能与不同炮制辅料对各成分的溶出度的影响有关；通过定量实验确定了桑枝的检测指标及检测方法，结果表明该方法具有分析评价能力良好、结果准确等优势，为进一步的药效研究奠定了基础。
3由不同炮制品中各化学成分的平均血药浓度-时间曲线(C-t曲线)及药动学参数结果表明，桑枝的炮制方法及大鼠的病理状态均影响药物成分在机体内的吸收。该方法专属性强、灵敏度高为后续研究桑枝及其有效化学成分的体内药效及其作用机理奠定了基础。