研究背景：骨肉瘤(Osteosarcoma)源于间叶组织,是以能产生骨样组织的梭形基质细胞为特征的恶性肿瘤,是原发性恶性骨肿瘤中最常见、恶性程度最高的一类骨肿瘤,好发于儿童和青少年期。在手术切除的基础上辅助阿霉素(Adriamycin, ADR)药物为主的联合化疗是目前临床主要治疗手段。尽管新型辅助化疗的应用极大地提高了骨肉瘤患者的5年存活率,但是骨肉瘤患者的预后一直很差,长期生存率仍徘徊不前。骨肉瘤易复发、易转移及患者对包括阿霉素在内的化疗药物产生原发或继发性耐药是目前导致临床化疗失败的主要原因。根据肿瘤干细胞理论,骨肉瘤肿瘤干细胞具有自我更新、强致瘤性、多向分化潜能、产生异质性肿瘤细胞及多重耐药性的生物学特征,因此骨肉瘤肿瘤干细胞的存在可能是临床化疗失败的关键原因之一。如果可以特异性的针对骨肉瘤肿瘤干细胞,尤其是化疗作用下骨肉瘤肿瘤干细胞相关特性的改变,可为深入认识骨肉瘤的发生发展提供新方向,并以此为基础寻找和发现靶向骨肉瘤肿瘤干细胞的药物,对于骨肉瘤的最终治愈具有不可估量的前景和价值。本论文通过考察一线化疗药物阿霉素对骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力的影响,发现人类Kruppel样因子4(K1f-4)是促进骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力的重要调控因子,进一步通过研究其调控骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力的作用及其分子机制,进而揭示调控骨肉瘤发生发展、转移和耐药等特性的新的关键因子；最后以Klf-4蛋白为潜在靶点筛选到以辛伐他汀为代表的他汀类药物能够抑制Klf-4蛋白,进而有效地拮抗了阿霉素促进的骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力作用,为骨肉瘤的靶向治疗策略提供全新的思路。第一部分：阿霉素影响骨肉瘤细胞的干细胞特性及肿瘤转移能力的作用及机制研究一.研究目的：虽然包括辅助化疗和新辅助化疗在内的化疗方案的引入极大地提高了骨肉瘤患者的5年生存率,但是骨肉瘤患者的预后一直很差,长期生存率一直徘徊不前。骨肉瘤易复发、易转移及患者对包括阿霉素在内的化疗药物产生原发或继发性耐药是目前导致临床化疗失败的主要原因。根据肿瘤干细胞理论,骨肉瘤肿瘤干细胞的存在可能是其化疗失败的关键因素,目前针对骨肉瘤化疗与肿瘤干细胞具体关系尚未见报道。本课题旨在研究骨肉瘤一线化疗药物阿霉素(Adriamycin, ADR)与骨肉瘤肿瘤干细胞特性及肿瘤转移能力的关系,阐明其作用机制,为临床靶向治疗骨肉瘤提供潜在靶点。二.研究方法：SRB法检测骨肉瘤细胞对药物的敏感性；siRNA干扰手段沉默目标蛋白；Western Blotting检测蛋白表达、qRT-PCR检测基因表达；流式细胞术检测干细胞标记物CD133的表达；肿瘤微球形成实验考察细胞的自我更新能力；细胞划痕修复和Transwell小室模型考察细胞迁移运动能力。三.研究结果：1.ADR对骨肉瘤肿瘤干细胞特性的影响：1)ADR可抑制骨肉瘤细胞的增殖能力且呈良好的剂量关系和时间关系；2)ADR能够引起KHOS/NP、U2OS和OS20三株骨肉瘤细胞的干细胞标记物CD133阳性表达率增加；3)ADR处理组的骨肉瘤细胞形成sphere的数目明显高于对照组；4)ADR作用能够显著提高骨肉瘤肿瘤干细胞标记物CD 133、ALDHA1和ABCG2的转录水平。2.ADR对骨肉瘤细胞转移能力的影响：1)ADR处理组的骨肉瘤细胞划痕修复能力显著高于对照组；2)ADR处理组的骨肉瘤细胞迁移至Transwell下室的细胞数目显著高于对照组。3.ADR对干细胞转录因子的影响：1)ADR作用骨肉瘤细胞后能够选择地激活Klf-4的mRNA转录；2)ADR作用骨肉瘤细胞后能够上调Klf-4蛋白表达水平。4.Klf-4对ADR促进的骨肉瘤肿瘤干细胞特性的影响：1)沉默Klf-4能够明显抑制ADR引起的CD133表达增加；2)沉默Klf-4能够明显减少ADR所引起sphere数目增加；3)沉默Klf-4能够明显减少A_DR促进的肿瘤干细胞标记物CD133、 ALDHA1和ABCG2的mRNA表达。5.KIf-4对ADR促进的骨肉瘤细胞转移能力的影响：1)沉默Klf-4能够抑制ADR引起的骨肉瘤细胞划痕修复能力增强；2)沉默Klf-4能够明显减弱ADR引起的骨肉瘤细胞迁移运动能力增强。四.研究结论：本研究首次发现一线化疗药物ADR能够增强骨肉瘤细胞的肿瘤干细胞特性及肿瘤转移能力,且这种作用依赖于Klf-4的蛋白水平的上调。本研究从肿瘤干细胞角度为解释患者在接受阿霉素治疗的过程中出现骨肉瘤的复发和转移现象提供了新视角。第二部分Klf-4调控骨肉瘤肿瘤干细胞特性及转移能力的作用研究一.研究目的：人类Kruppel样因子4(Klf-4)是Spl/Kruppel样锌指转录因子家族的成员之一,参与调控细胞增殖、分化、胚胎发育等重要生命过程。与已知的TGF-β一样,Klf-4在不同的遗传背景的细胞中具有癌基因或者抑癌基因的不同功能,而Klf-4对骨肉瘤的调控作用尚未见任何文献报道。第一部分研究显示Klf-4参与调控ADR对骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力的影响,提示Klf-4可能可以作为靶向骨肉瘤肿瘤干细胞的潜在靶点,本课题将进一步研究Klf-4在骨肉瘤中的表达水平与其自身恶性程度的可能关系以及其在骨肉瘤干细胞样模型中的表达,并以此为切入点,较为全面地阐明其与骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力的相互关系,从而揭示调控骨肉瘤发生发展、转移和耐药的关键因子,为骨肉瘤的治疗提供新的潜在分子靶点,有望进一步推动骨肉瘤的临床治疗。二.研究方法：慢病毒转染细胞构建目的基因过表达模型,siRNA干扰手段沉默目标蛋白；肿瘤微球形成实验检测细胞的自我更新能力；Western Blotting检测蛋白表达、qRT-PCR检测基因表达；细胞划痕修复和Transwell小室模型考察细胞迁移运动能力；台盼蓝拒染法结合血细胞板计数描绘细胞生长曲线；SRB法检测药物对细胞的增殖抑制能力,PI染色结合流式分析检测细胞周期分布以及药物诱导细胞发生凋亡能力；软琼脂糖克隆形成实验检测细胞克隆形成能力；裸小鼠移植瘤实验检测细胞成瘤能力。三.研究结果：1.Klf-4在不同骨肉瘤细胞中的表达情况：1)Klf-4在骨肉瘤原代样本OS21细胞中的表达水平高于原代样本OS15和OS20细胞；2)Klf-4蛋白在骨肉瘤细胞系KHOS/NP中的表达明显高于U20S和MG63细胞；3)Klf-4蛋白在骨肉瘤细胞形成的sphere干细胞球中的表达高于相应贴壁培养的正常细胞。2.Klf-4蛋白对骨肉瘤肿瘤干细胞特性的影响：1)过表达Klf-4能够显著增强骨肉瘤细胞的sphere形成能力；2)过表达Klf-4可引起多个干细胞经典转录因子mRNA水平的增加；3)过表达Klf-4能够引起Wnt、Notch、TGF-β和Hedgehog等干细胞相关信号通路的激活,同时能够增强间充质干细胞标记物的转录水平；4)沉默Klf-4能够明显抑制KHOS/NP细胞的克隆形成能力；5)在裸小鼠移植瘤模型上,Klf-4沉默的KHOS/NP细胞所形成的肿瘤,其平均体积和平均重量明显小于空载对照细胞,且具有显著性差异。3.KIf-4蛋白对骨肉瘤细胞周期和增殖能力的影响：1)过表达Klf-4能够使骨肉瘤细胞阻滞在G0/G1期；2)过表达Klf-4能够增加骨肉瘤细胞G0/G1期周期相关蛋白p21和p27的表达；3)Klf-4过表达可明显抑制骨肉瘤细胞的增殖能力。4.Klf-4蛋白对骨肉瘤细胞化疗敏感性的影响：1)过表达Klf-4蛋白能够降低化疗药物(阿霉素ADR和顺铂CDDP)对骨肉瘤细胞的增殖抑制能力；2)过表达Klf-4能够抵抗化疗药物引起的凋亡诱导作用；3)沉默Klf-4能够增强骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性；4)Klf-4蛋白表达的高低并不影响多药耐药基因ABCB1和ABCC1的表达,沉默Klf-4能够选择性地降低耐药相关的肿瘤干细胞标记物ABCG2的转录水平。5.Klf-4蛋白对骨肉瘤细胞转移能力的影响：1)过表达Klf-4能够引起骨肉瘤细胞发生间质样变化；2)过表达Klf-4能够上调骨肉瘤细胞间质样蛋白标记物FN. Vinmetin的表达水平；3)过表达Klf-4能够增强骨肉瘤细胞划痕修复能力；4)过表达Klf-4能够增强骨肉瘤细胞的运动迁移能力；5)沉默Klf-4蛋白能够抑制骨肉瘤细胞的划痕修复能力及细胞迁移运动能力；6)过表达Klf-4能够引起骨肉瘤细胞肺转移相关标记物CXCR-4的mRNA和蛋白水平上调,沉默Klf-4能够降低CXCR-4的mRNA和蛋白水平。6. p38MAPK信号通路对Klf-4调控的骨肉瘤肿瘤干细胞特性的影响：1)过表达Klf-4能够激活p38 MAPK信号通路；2)过表达Klf-4能够增强骨肉瘤细胞内p38的磷酸化水平,反之,沉默Klf-4则降低p-p38的表达水平；3)应用p38抑制剂或siRNA干扰p38蛋白表达,可减弱骨肉瘤细胞内Klf-4过表达所引起的sphere形成能力；4)p38抑制剂可以显著抑制Klf-4促进的骨肉瘤细胞转移能力。四.研究结论：Klf-4蛋白是维持骨肉瘤肿瘤干细胞特性所必须的,其表达水平与骨肉瘤的转移、耐药密切相关,而p38 MAPK信号通路则参与调控了Klf-4介导的骨肉瘤肿瘤干细胞特性。第三部分辛伐他汀通过抑制Klf-4蛋白拮抗ADR促进的骨肉瘤肿瘤干细胞特性一.研究目的：第一、二部分的研究结果显示,阿霉素增强骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力作用是通过上调Klf-4蛋白实现的,进一步地我们发现Klf-4蛋白的表达具有维持和促进骨肉瘤肿瘤干细胞特性的作用,因此,寻找以Klf-4蛋白为作用靶点的药物或抑制剂,将有助于实现抑制骨肉瘤肿瘤干细胞特性和有效提高阿霉素的临床疗效。然而目前市场上并没有针对Klf-4的特异性抑制剂或药物,基于此,本课题旨在寻找可以抑制Klf-4蛋白的药物来拮抗阿霉素促进的骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力,为临床靶向治疗骨肉瘤提供新策略。二.研究方法：慢病毒转染细胞构建目的基因过表达模型,Western Blotting检测蛋白表达、qRT-PCR检测基因表达；流式细胞术检测干细胞标记物CD133的表达；肿瘤微球形成实验考察细胞的自我更新能力；细胞划痕修复和Transwell小室模型考察细胞迁移运动能力；裸小鼠移植瘤实验检测细胞成瘤能力；免疫组化检测肿瘤组织样本中的目标蛋白表达。三.研究结果1.他汀类药物可抑制Klf-4蛋白进而影响骨肉瘤sphere形成能力：1)多个他汀类药物均能浓度依赖性的降低Klf-4蛋白的表达,其中辛伐他汀的作用最强；2)他汀类药物可以明显减少过表达Klf-4所促进的骨肉瘤sphere形成能力。2.辛伐他汀可以拮抗ADR促进的骨肉瘤肿瘤干细胞特性：1)辛伐他汀能够明显抑制ADR促进的干细胞标记物CD133表达比例；2)辛伐他汀能够显著减少ADR促进的肿瘤干细胞标记物CD133、ALDHA1和ABCG2的转录；3)辛伐他汀能够显著减少ADR促进的sphere形成数目增加。3.辛伐他汀可以拮抗ADR促进的骨肉瘤细胞转移能力：1)辛伐他汀能够明显抑制ADR增强的骨肉瘤细胞划痕修复能力；2)辛伐他汀能够显著抑制ADR引起的骨肉瘤细胞迁移运动能力增强。4.辛伐他汀通过抑制Klf-4拮抗ADR所促进的骨肉瘤细胞成瘤性：1)较高细胞密度(10×104/只)接种时,ADR给药组与生理盐水组的成瘤率均为100%,但ADR给药组平均成瘤体积大于生理盐水组；ADR合用辛伐他汀给药组的成瘤率(50%)明显低于ADR给药组,且平均瘤体积小于ADR给药组；2)较低细胞密度(2×104/只)接种时,与生理盐水组10%的成瘤率相比,ADR给药组的成瘤率明显提高(70%),ADR合用辛伐他汀给药组的成瘤率则明显低于ADR给药组,仅为20%；3)ADR给药组的肿瘤样本中Klf-4的表达水平高于生理盐水组,ADR合用辛伐他汀给药组的Klf-4表达水平则明显低于ADR给药组；4)ADR给药组的肿瘤样本中Klf-4和CD133的荧光表达水平高于生理盐水组,ADR合用辛伐他汀给药组的Klf-4和CD133的荧光表达水平则明显低于ADR给药组。四.研究结论：本研究发现了以辛伐他汀为代表的他汀类药物可以通过抑制Klf-4蛋白表达而有效地拮抗了阿霉素促进的骨肉瘤肿瘤干细胞特性和转移能力,提示临床阿霉素用药联合辛伐他汀为代表的他汀类药物可以更加有效地发挥抗骨肉瘤作用。