【摘 要】
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胰蛋白酶(Trypsin,EC 3.4.21.4)是一种广泛应用的丝氨酸蛋白酶,作为肽链内切酶能够识别精氨酸和赖氨酸残基,并在其羧基端切割。本论文以人源阴离子胰蛋白酶(Ht2)和猪源胰蛋白
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胰蛋白酶(Trypsin,EC 3.4.21.4)是一种广泛应用的丝氨酸蛋白酶,作为肽链内切酶能够识别精氨酸和赖氨酸残基,并在其羧基端切割。本论文以人源阴离子胰蛋白酶(Ht2)和猪源胰蛋白酶(Pt)为基础研究其活性及特异性不同。发现Pt在比活和切割效率上均优于Ht2。为研究227和217位甘氨酸对胰蛋白酶的活性及特异性影响,构建 Ht2-G217A、Ht2-G227A、Pt2-G217A、Pt2-G227A 突变体,结果发现,G217 位于底物结合口袋口处,G227位于底物结合口袋内部,对底物结合具有重要作用,突变为丙氨酸后,Pt的两种突变体及Ht2-G227A失去活性,而Ht2-G217A切割效率降低但对赖氨酸的特异性提高两倍。在胰蛋白酶的稳定性方面,研究Pt的自降解情况及其稳定性,对其自降解肽段进行质谱分析,推测122位、130位为自降解精氨酸位点,构建突变体Pt-R122L、Pt-R122H、和Pt-R122H-R130T,并比较其稳定性差异。验证了 122位、130位精氨酸为自降解精氨酸位点。相比于单突变体Pt-R122H双突变体Pt-R122H-R130T进一步提高了胰蛋白酶的温度及pH稳定性,RP-HPLC分析证实了自降解程度的的降低。
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