水稻是重要的禾本科粮食作物以及模式植物,近年来,对水稻基因的克隆以及功能分析不断取得新的成果,而水稻雄性不育研究是其中的一个热点。水稻的雄性不育主要是指不能获得有育性的花粉粒,而花粉粒的发育主要在花药中完成。目前,研究人员将花药发育分为14个时期,其中第1至7期主要为花药各层细胞的形成阶段,包括小孢子母细胞,花药壁细胞以及药隔维管组织的形成。花药发育第8期及以后,绒毡层进行了程序化的死亡进程（PCD）,并且有序的为小孢子提供养分,最终形成成熟的花粉粒。本研究报道了1个与雄性不育相关的水稻突变体Oryza sativa pectin defective tapetum 1（ospdt1）,主要结果如下:1 ospdt1的表型观察及基因定位1.1 OsPDT1参与水稻花粉粒的育性调控相比于野生型水稻,ospdt1突变体显示了完全不育的性状,进一步研究发现ospdt1突变体在花药发育成熟期不能获得有育性的花粉粒。通过对花药的横截面切片观察,发现在花药发育7到10期,ospdt1突变体及野生型没有明显差异。在花药发育12期,ospdt1突变体花药显示了异常的绒毡层凋亡及不育的花粉粒。透射电镜结果显示,在花药发育10到11期,ospdt1突变体小孢子出现了明显的花粉外壁缺陷及原生质体破碎,显示出小孢子发育异常;在花药发育11期,ospdt1突变体的绒毡层细胞异常膨大,并且发生了质壁分离现象,显示出绒毡层细胞异常凋亡。1.2 OsPDT1参与水稻花药绒毡层细胞的PCD调控ospdt1突变体的绒毡层细胞异常凋亡,因此,使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）实验进一步检测了野生型及ospdt1突变体花药绒毡层细胞的PCD进程,发现ospdt1突变体绒毡层细胞的PCD进程显著提前,在8a期出现了明显的PCD信号。ospdt1突变体中提前的绒毡层细胞的PCD进程是产生不育花粉粒的主要因素。1.3 OsPDT1编码一个半乳糖醛酸基转移酶通过图位克隆,将OsPDT1定位于第9染色体35kb的范围内。通过对区间内基因测序,发现LOC＿Os09g36190的第9个外显子发生了T碱基到A碱基的颠换,由亮氨酸（TTA）变为终止密码子（TAA）。通过功能互补实验,确认LOC＿Os09g36190就是OsPDT1,其编码一个半乳糖醛酸基转移酶。探索了OsPDT1在细胞内的定位,发现OsPDT1-GFP与OsPDT11-260aa-GFP在细胞内无定位信号,OsPDT11-141aa-GFP在细胞内定位于高尔基体。探索了OsPDT1的表达情况,RT-q PCR结果显示它在水稻成熟期的根、茎、叶、鞘、穗中有表达;通过m RNA原位杂交,发现它在花药囊中的表达部位主要为雄性生殖细胞及绒毡层细胞。2 OsPDT1基因的功能分析2.1 ospdt1突变体花药囊中的果胶含量并没有显著缺陷作为半乳糖醛酸基转移酶基因GAUT1的同源基因,OsPDT1可能参与了果胶中最丰富的多糖,同型多聚半乳糖醛酸的合成。然而,使用咔唑比色法并没有在野生型及ospdt1突变体小穗中发现明显的果胶差异。使用同型多聚半乳糖醛酸抗体JIM5和JIM7进一步检测了野生型及ospdt1突变体花药囊中的同型多聚半乳糖醛酸的分布,也没有发现明显差异。植物中的果胶主要存在于细胞壁,因此,上述检测的主要是细胞壁中的果胶含量。OsPDT1的突变很可能没有显著影响细胞壁中的果胶含量,不会引起细胞壁的结构缺陷,而是通过细胞内的果胶引起缺陷表型。2.2 OsPDT1的突变影响了Osi WAK1-EYFP的胞内分布细胞壁连接的类受体激酶家族蛋白是与果胶直接结合,并受其调控的一类蛋白。为了研究ospdt1突变体的果胶缺陷,探索了细胞壁连接的类受体激酶家族蛋白Oryza sativa indica Wall-associated Kinase 1（Osi WAK1）是否可以作为细胞内果胶研究的工具。发现Osi WAK1的胞外结构域可以在体外结合果胶多糖;Osi WAK1-EYFP的荧光信号在野生型原生质体内主要分布于分泌囊泡;将Osi WAK1的胞外结构域缺失获得的DEL-EYFP的荧光信号在野生型原生质体中不能定位于分泌囊泡;在ospdt1突变体原生质体中,Osi WAK1-EYFP的荧光信号在分泌囊泡中的定位显著减少。在Osi WAK1-EYFP超表达水稻（WEO）中,Osi WAK1-EYFP的荧光信号分布在花药壁细胞的细胞外围及分泌囊泡;而在ospdt1背景的Osi WAK1-EYFP超表达水稻（ospdt1/WEO）中,荧光信号在分泌囊泡中的分布显著减少。因此,ospdt1的胞内果胶可能产生了缺陷,影响了Osi WAK1-EYFP的胞内分布。进一步研究发现在分泌囊泡中的定位将有助于Osi WAK1-EYFP向细胞膜的运输。2.3 OsiWAK1参与水稻绒毡层细胞的PCD调控对Osi WAK1的敲减植株（WI）进行育性检测,发现它的育性严重下降,其绒毡层细胞的PCD进程提前。进一步检测了WEO的育性,发现其育性严重下降,并且在花药发育的成熟期出现了四分体样的花粉粒,其花药绒毡层细胞的PCD进程延迟。2.4 OsPDT1基因至少部分通过影响Osi WAK1的活性来参与绒毡层细胞的PCD进程检测了ospdt1/WEO的花药发育,发现其出现了与WEO相似的表型,并且部分恢复了ospdt1的表型。进一步检测了ospdt1/WEO的PCD进程,发现它的PCD进程在8a期恢复正常。该结果证明ospdt1的突变性状至少部分通过Osi WAK1的活性缺失引起,由此才可能被超表达Osi WAK1-EYFP所恢复。综上所述,OsPDT1的突变可能引起细胞内果胶的缺陷,从而影响Osi WAK1的细胞内定位及功能,并造成绒毡层PCD异常与完全的雄性不育性状。