一 研究目的乳腺癌（Breast Cancer）是目前全球女性最常见的恶性肿瘤之一,近年来其发病率和死亡率不断增长,位居恶性肿瘤首位,对患者生活造成极大影响。乳腺癌的危险因素复杂多样,其中包括遗传因素、生物学因素、生殖因素、生活因素、环境因素和精神心理因素等,其中生殖因素中雌激素（Estrogen）水平的高表达或者其分子通路效应的高活性是导致乳腺癌的重要因素,这己经是不可否认的事实。当雌激素在体内进行各种调节生理功能并发挥效应时,雌激素受体（Estrogen Receptor,ER）在这个过程中扮演着关键的介导作用。ER是一种类固醇物质,可以分为不同的亚型,其中核受体（nuclearreceptor,nER）作为经典的雌激素受体,包括ERα和ERβ两种,介导雌激素慢速基因组效应。近年来研究证实,除核受体外,新型的膜受体（membrane receptor,mER）——G 蛋白偶联雌激素受体（G protein coupled estrogen receptor,GPER）同样可与雌激素结合,但介导快速非基因组效应,在乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌等相关肿瘤发生和演变中也发挥着重要作用,并且由于其广泛表达于多种组织,发挥作用时间短,不需要任意一种核受体同时表达,越来越成为近年来的研究热点。多项研究表明紫草素（Shikonin,SK）作为中药紫草的一种主要成分,具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、促进伤口愈合等作用,其中抗肿瘤作用尤为显著,对抑制乳腺癌、宫颈癌细胞增殖等有许多相关研究,其中的作用机制包括:紫草有可能抑制了磷脂酰肌醇激酶3/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路、诱导凋亡细胞膜表面暴露钙网织蛋白、调节Bcl-2家族蛋白等等,对于ER信号通路相关研究较少。本实验主要利用乳腺癌 MCF-7（ERα+/ERβ-/GPER+）和 SK-BR-3（ERα-/ERβ-/GPER+）两种细胞,来观察SK对二者增殖、周期和凋亡的影响,以及SK对ER两种不同的受体nER和mER及其下游靶基因的影响,进而从细胞和分子水平探讨ER介导紫草素抗乳腺癌细胞作用的机制。二研究方法和结果1 紫草素对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响实验研究采用MTT细胞增殖实验检测紫草素对MCF-7、SK-BR-3细胞增殖的抑制效应;流式细胞术检测细紫草素对MCF-7、SK-BR-3细胞增殖周期的影响;AnnexinVFITC/PI双染法检测紫草素对MCF-7、SK-BR-3细胞凋亡的影响。结果:1×10^-6 1×10^-7、1×10^-8mol/L紫草素浓度组与空白对照组相比,对MCF-7、SK-BR-3细胞均具有抑制作用,有统计学意义（P<0.05）,1×10^-8mol/L雌二醇阳性对照组与空白组比较增值率都有所升高（P<0.01）。流式细胞术检测发现紫草素干预后,MCF-7细胞阻滞于G0/G1期,S期细胞增加,延缓细胞周期;SK-BR-3细胞周期无明显变化。Annexin V FITC/PI双染结果发现紫草素作用后可使MCF-7、SK-BR-3细胞凋亡率上升。2 紫草素对乳腺癌细胞雌激素核受体（nERs）和膜受体（mER）表达的影响以 MCF-7 细胞（nERs+/mER+）和 SK-BR-3 细胞（nERs-/mER+）为研究对象,通过Western blot免疫印迹法验证nERs（ERα、ERβ）和mER（GPER）三种蛋白在MCF-7和SK-BR-3细胞中表达,并检测不同浓度SK作用后ERα、GPER两种蛋白表达的情况,以及雌二醇作用条件下,1×10^-6mol/L的SK对ERα、GPER两种蛋白的影响;细胞免疫组化技术检测ERα及GPER蛋白在MCF-7和SK-BR-3细胞中的定位表达。结果:MCF-7细胞中,ERα、ERβ和GPER都为阳性表达,SK-BR-3细胞中,ERα、ERβ为阴性表达,GPER呈阳性表达,验证了这两种细胞的ER属性。在MCF-7细胞中,SK各组可以降低ERα和GPER的表达,其中1×10^-6mol/L抑制作用最强;在SK-BR-3细胞中,ERα呈阴性表达,1×10^-6mol/LSK浓度组对GPER蛋白有抑制作用,提示紫草素可能通过ER通路抑制MCF-7和SK-BR-3细胞。与空白对照组比较,雌二醇干预后MCF-7细胞中ERα、GPER表达量有所提高,1 ×10^-6mol/LSK单独作用后ERα和GPER表达降低,雌二醇和1×10^-6mol/LSK共同作用后ERα和GPER表达降低,提示在模拟人体雌激素环境下SK对于ERα和GPER蛋白仍具有抑制作用。细胞免疫组化结果显示,在MCF-7细胞中,ERα蛋白各组棕黄色颗粒阳性表达位于细胞核,与空白对照组相比,雌二醇组表达量显著增多,呈较深棕色;1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8mol/L SK各组表达较少,呈淡棕色;GPER蛋白各组棕黄色阳性表达位于细胞膜,与空白对照组比较,雌二醇组表达量增多,呈深棕色;1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8mol/LSK各组表达较少,呈淡棕色。在SK-BR-3细胞中,因WB已检测出ERα呈阴性表达故未检测;GPER蛋白各组棕黄色阳性表达位于细胞膜,与空白对照组比较,雌二醇组表达量增多,呈深棕色;1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8mol/LSK各组表达较少,呈淡棕色。3 紫草素对乳腺癌细胞中GPER信号通路下游EGFR/p-ERK蛋白表达的影响以MCF-7和SK-BR-3细胞为研究对象,应用Western blot法观察SK、GPER特异性激动剂G1和抑制剂G15以及雌二醇的干预下,对GPER下游基因EGFR和p-ERK表达的影响,探讨SK抑制MCF-7和SK-BR-3细胞增殖的GPER靶向机制。细胞免疫组化技术检测EGFR和p-ERK蛋白在MCF-7和SK-BR-3细胞中的定位表达。结果:SK各浓度组可降低MCF-7、SK-BR-3细胞中EGFR和p-ERK的表达,抑制作用明显。经SK和G1共同干预后,MCF-7细胞中EGFR和p-ERK表达减弱明显;SK-BR-3细胞中p-ERK表达被抑制,提示GPER激动剂G1与SK结合会进一步抑制EGFR和p-ERK表达,说明SK经过激动后的GPER蛋白对EGFR和p-ERK发挥了更强的抑制作用。SK和雌二醇共同作用后与空白对照组比较,MCF-7和SK-BR-3细胞中的EGFR和p-ERK的表达有明显降低,提示在雌激素环境下SK对于EGFR和p-ERK蛋白仍具有抑制作用。细胞免疫组化结果显示,在MCF-7和SK-BR-3细胞中,EGFR蛋白表达位于细胞膜,与空白对照组相比,雌二醇组表达量显著增多,呈较深棕色;SK各组表达较少,呈淡棕色;p-ERK蛋白表达位于细胞质,与空白对照组比较,雌二醇组表达量增多,呈深棕色;SK各组表达较少,呈淡棕色。4 紫草素对ERα阳性乳腺癌细胞中cyclin D1蛋白表达的影响以MCF-7细胞为研究对象,应用Western blot法观察不同浓度SK、SK与雌二醇的共同干预对ERα下游基因cyclin D1表达的影响,探讨SK影响MCF-7细胞周期的ERα/cyclin D1靶向机制。细胞免疫组化技术检测cyclin D1在MCF-7细胞中的定位表达。结果:与空白对照组比较,雌二醇组cyclinD1的蛋白表达量有所提高,SK各浓度组cyclinD1表达水平降低,其中1×10^-6mol/LSK对cyclinD1表达抑制作用最强。雌二醇和SK共同作用对cyclin D1蛋白量的表达具有抑制作用,提示SK在雌二醇作用下仍对MCF-7细胞中的cyclinD1蛋白具有抑制作用。免疫组化结果显示,在MCF-7细胞中,cyclin D1蛋白表达位于细胞质和细胞核中,与空白对照组比较,雌二醇组表达量增多,SK各组表达较少。三研究结论1 细胞水平增殖和凋亡实验显示:SK能够抑制MCF-7和SK-BR-3细胞的增殖,诱导二者细胞凋亡,并将MCF-7细胞周期阻滞于G0/G1期,延缓其增殖进程。2 SK抑制MCF-7和SK-BR-3细胞的增殖的机制具有ER靶向性。SK作用于这两种细胞后,ER途径中核受体ERα和膜受体GPER蛋白表达均有所降低,并且这种抑制作用不受雌激素环境的影响。3 SK通过膜受体信号途径抑制乳腺癌细胞增殖,诱导细胞凋亡可能由GPER/EGFR/p-ERK信号通路介导。4 SK通过核受体信号途径影响nERs+乳腺癌细胞的增值周期,延缓细胞增殖进程,可能由ERα下游的cyclinD1蛋白介导。