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龙胆（Gentianae Radix et Rhizoma，GRR）是一种常用的清热燥湿类中药，中医临床上用于治疗湿热黄疸、肝火头痛，惊风抽搐及消化系统等疾病，其主要活性物质龙胆苦苷属于环烯醚萜类成分。2020版《中国药典》将四种龙胆科龙胆属植物的干燥根及根茎同列为中药龙胆的正品来源，分别是：三花龙胆 Gentiana trifloraPall.、条叶龙胆Gentiana manshurica Kitag.、龙胆Gentiana scabra Bge.和坚龙胆Gentiana rigescens Franch.其中前三种属于龙胆属中龙胆草组Sect. Pneumonanthe植物，主产于我国东北地区，习称“关龙胆”；坚龙胆属与龙胆属多枝组头花系Ser. Apteroideae植物，主产于我国云南省。四种龙胆中物质成分的差异仍不明确，目前尚无系统的化学表征方法研究；市售龙胆药材因产地不同有南、北龙胆之分，但统称为“龙胆草”，质量参差不齐；以龙胆苦苷为单一指标的含量测定不能体现中药龙胆的整体质量，严重阻碍了龙胆药材质量的有效控制。针对上述问题，本文基于超高效液相-高分辨质谱（Ultra-High Performance Liquid Chromatography Tandem High-Resolution Mass Spectrometry，UPLC-HRMS）分析平台，结合新型信息学软件，提出靶向研究龙胆中环烯醚萜类成分群策略，旨在建立灵敏、高效的靶向表征方法，对多基原龙胆中环烯醚萜成分进行系统的表征和比较，阐明多基原龙胆物质基础，建立以龙胆苦苷为内参物的其他8个环烯醚萜类物质一测多评法的多指标定量方法，从而为提高中药龙胆质量控制方法的可靠性奠定科学基础。
基于以上问题，本课题开展以下几方面研究：
一、首先构建龙胆药材样品库，收集并鉴定多基原龙胆样本88批（其中包括G.scabra52批，G.manshurica3批，G.rigescens33批和G. triflora0批），市售龙胆药材30批，共计118批样本；然后基于UPLC分析平台，建立多基原龙胆指纹图谱质量评价方法，并对该方法进行方法学验证，然后采用相似度评价、主成分分析和正交偏最小二乘法对市售龙胆药材进行质量评价。
二、建立龙胆属环烯醚萜数据库，收录环烯醚萜结构129个，通过系统研究对照品裂解规律及多边质量亏损过滤结合母离子列表依赖的多维度数据采集的方式对龙胆中环烯醚萜类物质进行靶向表征。首先，采用UPLC/LTQ-Orbitrap高分辨质谱平台在负离子模式下研究10个环烯醚萜对照品的 MSn裂解途径，总结环烯醚萜类化合物结构裂解规律，通过比较碰撞诱导解离（ Collision-Induced Dissociation，CID）模式下，不同裂解能对环烯醚萜对照品裂解行为的差异，建立龙胆中环烯醚萜类物质多级裂解MSn的碎片获取方法。然后，构建基于多边质量亏损过滤（Mass defect filter，MDF）结合多维度数据采集的靶向表征方法，根据自建的129个龙胆属环烯醚萜数据库，建立多边 MDF筛选窗口，靶向过滤潜在环烯醚萜，然后结合母离子列表（Precursor Ion List，PIL）质量分段模式及时间分段模式相结合的多维度数据采集方法，高选择性地触发化合物二级质谱裂解的数量，使多基原龙胆中的痕量及微量环烯醚萜类物质进行充分暴露，进而完成表征研究，最终共鉴定四种龙胆中环烯醚萜共433个。
三、基于非靶向植物代谢组学方法对多基原龙胆间的化学成分进行比较。研究使用 UPLC/LTQ-Orbitrap高分辨质谱仪对龙胆和坚龙胆85批样品进行数据非依赖采集DIA，接着采用组学分析方法，应用Progenesis QI及SIMCA软件进行多元统计分析，通过无监督的PCA模型可以看出，两种龙胆整体化学轮廓差异较大，并且种内差异明显小于种间差异，表明龙胆和坚龙胆能很好地区分；进而利用有监督的OPLS-DA进行建模筛选出VIP值大于1的47个变量，然后进一步采用随机森林模型对47个差异性代谢特征进一步精简，统计每一次建模过程中变量的重要性，以及变量重要性的排序，最终发现了11个潜在变量，可作为用以区分龙胆和坚龙胆的化学标志物。
四、基于UPLC平台，构建一测多评法（Quantitative Analysis of Multi-Components by a Single Marker，QAMS）用于多基原龙胆中9个环烯醚萜成分的多指标定量分析方法，并根据结果对市售龙胆进行了综合评价。首先通过对提取条件和液相条件的优化，建立QAMS研究方法，继而完成了专属性、准确性、精密度、稳定性、线性范围及校正因子适用性等方法学验证，并选择Gentiopicroside为内参物，分别用斜率法和多点校正法计算了6-glu-Loganic acid、Loganic acid、Secologanoside、6-glu-Gentiopicroside、Swertiamarin、Sweroside、Rindoside和Trifloroside的相对校正因子，通过比较外标法与QAMS法计算的88批龙胆药材中9个指标成分的含量结果，计算标准方法差异值（Standard method difference， SMD），最后QAMS计算市售龙胆药材中的9个环烯醚萜成分的含量，并根据计算结果应用多指标决策分析TOPSIS对市售龙胆药材进行综合评价。
通过以上研究，本文创新性在于提出了基于液质联用技术的靶向表征龙胆中环烯醚萜新策略，为中药复杂体系中目标成分的靶向选择提供了新思路；通过非靶向植物代谢组学研究及多元统计模型，找到了龙胆和坚龙胆的化学标志性成分，为中药的植物基原判别提供了新方法；采用一测多评法对多基源龙胆中的9个环烯醚萜进行定量研究，并对30批市售龙胆药材进行了整体的综合评价，为进一步研究龙胆多基原共用是否合理提供科学依据，为构建科学合理的中药龙胆质量标准奠定基础。
基于以上问题，本课题开展以下几方面研究：
一、首先构建龙胆药材样品库，收集并鉴定多基原龙胆样本88批（其中包括G.scabra52批，G.manshurica3批，G.rigescens33批和G. triflora0批），市售龙胆药材30批，共计118批样本；然后基于UPLC分析平台，建立多基原龙胆指纹图谱质量评价方法，并对该方法进行方法学验证，然后采用相似度评价、主成分分析和正交偏最小二乘法对市售龙胆药材进行质量评价。
二、建立龙胆属环烯醚萜数据库，收录环烯醚萜结构129个，通过系统研究对照品裂解规律及多边质量亏损过滤结合母离子列表依赖的多维度数据采集的方式对龙胆中环烯醚萜类物质进行靶向表征。首先，采用UPLC/LTQ-Orbitrap高分辨质谱平台在负离子模式下研究10个环烯醚萜对照品的 MSn裂解途径，总结环烯醚萜类化合物结构裂解规律，通过比较碰撞诱导解离（ Collision-Induced Dissociation，CID）模式下，不同裂解能对环烯醚萜对照品裂解行为的差异，建立龙胆中环烯醚萜类物质多级裂解MSn的碎片获取方法。然后，构建基于多边质量亏损过滤（Mass defect filter，MDF）结合多维度数据采集的靶向表征方法，根据自建的129个龙胆属环烯醚萜数据库，建立多边 MDF筛选窗口，靶向过滤潜在环烯醚萜，然后结合母离子列表（Precursor Ion List，PIL）质量分段模式及时间分段模式相结合的多维度数据采集方法，高选择性地触发化合物二级质谱裂解的数量，使多基原龙胆中的痕量及微量环烯醚萜类物质进行充分暴露，进而完成表征研究，最终共鉴定四种龙胆中环烯醚萜共433个。
三、基于非靶向植物代谢组学方法对多基原龙胆间的化学成分进行比较。研究使用 UPLC/LTQ-Orbitrap高分辨质谱仪对龙胆和坚龙胆85批样品进行数据非依赖采集DIA，接着采用组学分析方法，应用Progenesis QI及SIMCA软件进行多元统计分析，通过无监督的PCA模型可以看出，两种龙胆整体化学轮廓差异较大，并且种内差异明显小于种间差异，表明龙胆和坚龙胆能很好地区分；进而利用有监督的OPLS-DA进行建模筛选出VIP值大于1的47个变量，然后进一步采用随机森林模型对47个差异性代谢特征进一步精简，统计每一次建模过程中变量的重要性，以及变量重要性的排序，最终发现了11个潜在变量，可作为用以区分龙胆和坚龙胆的化学标志物。
四、基于UPLC平台，构建一测多评法（Quantitative Analysis of Multi-Components by a Single Marker，QAMS）用于多基原龙胆中9个环烯醚萜成分的多指标定量分析方法，并根据结果对市售龙胆进行了综合评价。首先通过对提取条件和液相条件的优化，建立QAMS研究方法，继而完成了专属性、准确性、精密度、稳定性、线性范围及校正因子适用性等方法学验证，并选择Gentiopicroside为内参物，分别用斜率法和多点校正法计算了6-glu-Loganic acid、Loganic acid、Secologanoside、6-glu-Gentiopicroside、Swertiamarin、Sweroside、Rindoside和Trifloroside的相对校正因子，通过比较外标法与QAMS法计算的88批龙胆药材中9个指标成分的含量结果，计算标准方法差异值（Standard method difference， SMD），最后QAMS计算市售龙胆药材中的9个环烯醚萜成分的含量，并根据计算结果应用多指标决策分析TOPSIS对市售龙胆药材进行综合评价。
通过以上研究，本文创新性在于提出了基于液质联用技术的靶向表征龙胆中环烯醚萜新策略，为中药复杂体系中目标成分的靶向选择提供了新思路；通过非靶向植物代谢组学研究及多元统计模型，找到了龙胆和坚龙胆的化学标志性成分，为中药的植物基原判别提供了新方法；采用一测多评法对多基源龙胆中的9个环烯醚萜进行定量研究，并对30批市售龙胆药材进行了整体的综合评价，为进一步研究龙胆多基原共用是否合理提供科学依据，为构建科学合理的中药龙胆质量标准奠定基础。