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第一部分中间丝蛋白Nestin在间质纤维化动物模型肾小管上皮细胞转分化中表达的研究背景肾小管间质纤维化是一系列慢性肾脏疾病进展到终末期肾病的决定性因素之一,肾小管上皮细胞—肌成纤维细胞转分化（Epithelial-myofibroblast transition,EMT）在间质纤维化过程中发挥了重要的致病作用。巢蛋白（Nestin）属于第Ⅵ类中间丝蛋白,可能在各种细胞骨架蛋白中起桥梁作用,参与调节整个细胞骨架结构的稳定。我们先前的研究于国内外率先发现:在肾脏发育阶段,Nestin一过性表达于分化未成熟的小管上皮细胞,而在分化成熟的小管上皮细胞中再无表达。肾间质纤维化时,由于EMT过程涉及肾小管上皮细胞的去分化以及细胞形态和迁移能力的改变,因而肾小管发育阶段曾表达的Nestin有可能重新表达于肾小管上皮细胞并发挥一定的作用。因此,我们通过构建单侧输尿管梗阻（UUO）的肾间质纤维化动物模型,观察肾小管EMT过程中是否出现Nestin的表达。方法选用60只200-250g雄性SD大鼠,建立UUO动物模型,以假手术大鼠为对照,分别于手术后3天、6天、11天和14天处死大鼠。Masson染色观察大鼠间质纤维化情况,免疫组化法检测大鼠TGFβ1、上皮细胞表型特异性标志物E-钙粘蛋白、肌成纤维细胞表型标志物-平滑肌肌动蛋白α（αSMA）及Nestin在肾脏的表达;免疫荧光共染色检测Nestin和E-钙粘蛋白/αSMA表达的关系;实时定量PCR法检测大鼠皮质Nestin mRNA水平;Western blot法检测Nestin、E-钙粘蛋白和αSMA的蛋白水平;Pearson法分析Nestin改变与皮质间质容量分数及E-钙粘蛋白、αSMA蛋白表达的相关性。结果与对照大鼠比,随着输尿管梗阻时间的延长,大鼠肾间质纤维化面积逐渐增加,术后3天为2.1%,6天达到12.2%,11天时为18.0%,14天间质有近30%的面积出现纤维化,均有统计学意义（P＜0.05）。UUO大鼠的间质和小管内出现TGFβ1的表达。与此同时,随梗阻时间延长,UUO大鼠肾小管上皮表型E-钙粘蛋白表达下降,11天时下降明显,14天时表达量几乎无法检测到(UUO11d0.34±0.041,UUO14d0.02±0.007 vs CON 1.19±0.087,P＜0.05);肌成纤维细胞表型αSMA自术后3天即呈时间依赖性增加（与对照比P＜0.05）。大鼠小管EMT的同时,间质和小管部位先后出现Nestin的表达,荧光染色显示UUO6天时大鼠Nestin表达于E-钙粘蛋白缺失的小管上皮,并部分与αSMA共表达。随手术时间延长,Nestin mRNA和蛋白水平均呈时间依赖性增加。Nestin蛋白水平与间质纤维化程度（r=0.816,P＜0.05）及αSMA蛋白水平（r=0.97,P＜0.05）呈正相关,与E-钙粘蛋白水平呈负相关（r=-0.816,P＜0.05）。结论（1）在UUO间质纤维化动物模型中,存在着肾小管上皮细胞的转分化;（2）伴随着EMT的发生,分化未成熟小管上皮细胞标志物Nestin再次表达;（3）Nestin的表达与肾间质纤维化程度及细胞表型特异性标志物的改变密切相关。第二部分Nestin在体外培养的人近端小管上皮细胞转分化中的研究背景肾小管上皮细胞是肾脏中生理功能最活跃的细胞之一,各种损伤因素,如缺血、缺氧、蛋白尿以及免疫炎症均可导致小管上皮细胞的损伤,损伤的小管上皮细胞发生活化,其细胞运动、迁移、吞噬等能力显著增强。而肾小管上皮细胞在组织发生过程中与间质成纤维细胞具有同源性,在一定的病理条件下可以发生上皮细胞—肌成纤维细胞转分化,直接参与肾间质纤维化损伤过程。Nestin作为中间丝蛋白的一种,在调控整个细胞骨架蛋白网络结构的稳定性中具有一定的作用,在肾脏发育早期,Nestin表达于分化未成熟的小管上皮细胞,参与其分化过程。我们前一部分的动物研究已经证实,分化未成熟小管上皮细胞标志物Nestin在肾间质纤维化小管EMT的过程中再次表达。因此,本部分研究将以体外培养的人近端小管上皮细胞（HKC）为观察对象,用TGFβ1诱导其转分化,体外验证小管EMT时,Nestin是否重新表达及其与肾小管上皮细胞去分化表型改变及细胞迁移能力的关系。方法体外人近端小管上皮细胞（HKC）培养,以5ng/ml转化生长因子β1（TGFβ1）干预不同时间,以非干预组为对照。实时定量PCR法检测Nestin mRNA水平,免疫荧光法及Western blot法检测Nestin、E-钙粘蛋白、αSMA的表达,Transwell迁移实验检测细胞迁移能力。结果TGFβ1干预HKC72小时后,细胞形态由鹅卵石样变为长梭形。E-钙粘蛋白呈时间依赖性下调,6小时,12小时,24小时,36小时后分别比未干预组下降25.7%,62.0%,84.2%和92.8%（P＜0.05）,而48小时后,E-钙粘蛋白表达完全缺失;基础状态下,HKC内无αSMA表达,TGFβ1干预36小时后,HKC中可检测到αSMA蛋白表达阳性,提示体外培养的HKC发生转分化。转分化后HKC细胞迁移能力显著增强,为对照细胞的15.37倍（P＜0.05）。Nestin的mRNA水平自TGFβ1作用6小时后,即出现上调,比对照组增加了17.2%（P=0.04）,随TGFβ1作用时间的延长,Nestin mRNA的水平呈时间依赖性增加;Nestin的蛋白水平自24小时起开始增加,24小时,36小时,48小时和72小时分别比对照组增加了14.6%、95.5%、104.1%和100.8%（与对照组相比,P＜0.05）。Nestin蛋白表达的出现要早于E-钙粘蛋白表达的完全缺失及αSMA蛋白的表达的出现。结论（1）TGFβ1可以诱导体外培养的HKC转分化,表现为上皮细胞表型E-钙粘蛋白的下调和肌成纤维细胞表型αSMA的出现及细胞迁移能力的增强;（2）HKC转分化的同时,分化未成熟小管上皮细胞标志物Nestin再次表达,其蛋白表达早于上皮表型E-钙粘蛋白的缺失及肌成纤维细胞表型αSMA的出现。第三部分Nestin对体外培养的肾小管上皮细胞转分化后细胞迁移能力的影响背景正常情况下,肾小管上皮细胞和间质肌成纤维细胞由肾小管基底膜分隔开来,因此,转分化的小管上皮细胞只有具备了一定的迁移能力才能突破基底膜进入肾间质。我们前一部分的研究采用Transwell技术证实,体外培养的HKC经TGFβ1诱导转分化后细胞的迁移能力增加。以往的研究显示,细胞迁移能力的改变与细胞骨架蛋白结构的重组密切相关。而Nestin是一种结构特殊的第Ⅵ类中间丝蛋白,有可能在各种细胞骨架蛋白中起桥梁作用,参与调节整个细胞骨架结构的稳定。因此,本部分的研究将通过RNA干扰技术,下调Nestin的mRNA和蛋白表达,进而观察Nestin对于HKC转分化细胞特异性表型的表达及细胞迁移能力的影响,探讨Nestin参与EMT的可能机制。方法构建靶向Nestin并带有U6启动子和编码绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的短发夹状双链RNA的真核表达质粒（shRNA-Nestin）,转染体外培养的HKC。观察TGFβ1诱导转分化后HKC细胞表型特异性标志物的表达及细胞迁移能力的改变。结果转染shRNA-Nestin干扰质粒后能一定程度抑制转分化后HKC内Nestin蛋白表达,抑制率为35%左右（与对照质粒相比,P＜0.05）。下调Nestin的表达并不改变E-钙粘蛋白表达减少的趋势及αSMA表达增加的趋势（与对照质粒和非转染组相比,P均＞0.05）,但是下调Nestin表达后能导致转分化后细胞迁移能力明显下降（128.40±12.4 vs非转染组193.73±13.51细胞/视野,P＜0.05）,抑制率为33.72%。而转染对照质粒的HKC细胞迁移能力无明显改变（189.97±11.96 vs非转染组193.73±13.51细胞/视野,P＞0.05）。结论Nestin通过影响转分化后HKC细胞的迁移能力参与了肾小管EMT的动态进展过程,这将为阐明肾间质纤维化过程中小管EMT的细胞分子机制,进而全方位阻断慢性肾脏病（CKD）进展提供新的研究和治疗靶点。