研究背景与目的:　　抗原处理与提呈在特异性免疫应答中发挥重要作用，抗原处理与提呈不仅能启动特异性T细胞应答和B细胞应答，也是决定特异性免疫应答类型的重要因素。发挥抗原处理与提呈功能的细胞被称为抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APCs），其中树突状细胞（dendritic cells，DCs）、单核吞噬细胞和B细胞为专职 APCs（professional APCs），上皮细胞、内皮细胞和靶细胞等被称为非专职APC（non-professional APCs）。抗原处理与提呈也在胸腺组织中发生。胸腺组织中存在胸腺上皮细胞、树突状细胞和巨噬细胞等胸腺基质细胞，它们构成T细胞在胸腺成熟的微环境，这些细胞表面表达MHC-I类分子和MHC-II类分子，也存在与抗原摄取和提呈相关的模式识别受体（ pattern recognition receptor， PRR）、补体受体（ complement receptor， CR）、协同刺激分子（co-stimulating molecular）等，这些细胞也能分泌多种细胞因子。这些细胞正是通过其膜表面分子、及其释放的细胞因子等因素影响 T细胞在胸腺的分化成熟过程，影响不同T细胞亚群的成熟。重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是T细胞依赖性自身免疫性疾病，多数（80％以上）患者存在胸腺增生、胸腺瘤等异常表现。T细胞在胸腺分化成熟过程中，需要与胸腺皮质上皮细胞、胸腺髓质上皮细胞和胸腺树突状细胞相互作用，经历阳性选择、阴性选择后获得MHC限制性和自身耐受性，才能分化为成熟的功能性 T细胞，到达外周发挥重要的免疫学作用。阳性选择和阴性选择的重要机制就是胸腺上皮细胞和胸腺树突状细胞的抗原提呈作用。因此探讨重症肌无力患者胸腺组织中树突状细胞及与抗原提呈相关基因的表达有助于揭示MG患者T细胞异常分化的机制，为临床疾病的诊治打下基础。　　1、材料与方法:　　1.1、胸腺组织RNA抽提　　取50mg去筋膜、血污后的胸腺组织，加入ImL TRIZOL试剂，用匀浆器反复研磨制成匀浆。将匀浆置室温（15到30℃）孵育5分钟，使核酸蛋白复合体完全解离。每1ml的TRIZOL试剂匀浆中加入0.2ml的氯仿，剧烈振荡15s再置室温孵育3min。4℃12,000g离心15min。小心吸取水相，并将其转移至新管中。向水相中以1ml TRIZOL试剂加0.5ml的比例加入异丙醇，混匀，室温孵育10min，4℃12,000 g离心10min。去上清，加入1ml75%乙醇，清洗RNA沉淀。去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10min。加入不含RNA酶的水，反复吹打，60℃孵育10min使RNA溶解。-70℃保存。　　1.2、 RNA纯化及质量检测　　按照产品说明书将RNA溶液过柱（RNeasy MinElute Spin Column）、洗脱，获得纯化RNA。紫外吸收测定法检测RNA纯度：用A260/A280的比值检测RNA纯度。变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度：制作1%变性琼脂糖凝胶，取0.5μg RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育5分钟使样品变性。上样后，5–6V/cm电压下电泳。紫外透射光下观察、拍照。　　1.3、 cDNA合成　　取1.5μg RNA，加入500ng/μl oligo（dT）1μL，10mM dNTPs Mix1μL，最后加灭菌水至13μL。混匀后，置65℃5min冰上1min，短促离心后向离心管中依次加入5× First-Strand Buffer4μl、0.1M DTT1μl、RNase Inhibitor1μl、SuperScript III RT1μl。混匀，50℃温育60min，70℃15min使酶失活。每20μl cDNA加91μl灭菌水混匀，-20℃保存。　　1.4、实时定量PCR　　取已稀释的cDNA102μL，加入2× SuperArray PCR master mix550μL，ddH2O448μL。打开PCR Array上的膜、加10ul混合液到PCR Array对应的每个孔中，小心盖上盖子密封PCR Array，在设置PCR程序前将准备好的PCR Array放在冰上，实时定量PCR程序设置完后，将PCR Array置于实时定量PCR仪进行PCR反应。步骤如下：聚合酶激活、变性95℃，10min；95℃15s、60℃1min，扩增40个循环。收集荧光，进行溶解曲线分析。　　1.5、数据分析与统计学分析　　采用ΔΔCt方法。计算每一实验组和对照组中每个基因的ΔCt，ΔCt(group1)=average Ct–average of HK genes’ Ct for group1 array，ΔCt(group2)=average Ct–average of HK genes’ Ct for group2 array。计算2个PCR Array（或两组）中每个基因的ΔΔCt，ΔΔCt=ΔCt(组2)-ΔCt(组1)，通常组1是对照，组2是实验组。同过2-ΔΔCt计算组2与组1对应基因的表达差异。当实验组与对照组2-ΔΔCt之比大于2或小于0.5，为显著增高或降低。统计学分析（p值）采用Student’s t检验，计算对照组和实验组每个基因的2^(-Delta Ct)值, p<0.05为有统计学意义。　　2、结果：　　2.1、树突状细胞和抗原提呈细胞PCR芯片的基因分类　　该基因芯片中含有84种基因，根据这些基因的功能不同将其分为8类基因，即：抗原摄取相关基因、抗原提呈相关基因、DCs趋化作用相关基因、DCs分化相关基因、细胞因子、细胞因子受体相关基因、其它细胞表面受体基因、信号转导基因。　　2.2、 MG患者与对照组胸腺组织基因表达的差异　　经荧光定量PCR检测和统计学分析，从84种检测的基因中发现9种基因表达在MG患者胸腺组织显著高于对照组。从MG患者胸腺组织异常表达基因的功能分析，这些基因主要集中在2个方面： TAP2、CD4和THBS1是与抗原摄取、抗原提呈相关的基因；CCL2、CCL3、CXCL2、IFN-γ、IL-6和ERBB2是细胞因子和细胞因子受体相关的基因。　　3、结论：　　重症肌无力患者胸腺组织抗原处理和抗原提呈相关的部分基因表达存在异常，主要表现在TAP2、CD4、THBS1、CCL2、CCL3、CXCL2、IFN-γ、IL-6和ERBB2，这些基因的异常表达可能与MG患者T细胞异常分化相关。